Nahrungsmittelallergien: Identifizierung und Charakterisierung von nicht-birkenpollenassoziierten Allergenen der Haselnuß
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Kiel
Inst. für Experimentelle Toxikologie
2002
|
| Schriftenreihe: | Schriftenreihe des Instituts für Experimentelle Toxikologie, Universitätsklinikum Kiel
51 |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Kiel, Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | XIII, 145 S. Ill., graph. Darst. : 30 cm |
Internformat
MARC
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
VI
VERZEICHNIS
DER
TABELLEN
.
X
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
.
XI
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
NAHRUNGSMITTELALLERGIE
.
1
1.1.1
EPIDEMIOLOGIE
.
1
1.1.2
IMMUNOLOGISCHE
GRUNDLAGEN
.
1
1.1.3
KLINIK
.
3
1.1.4
KLASSISCHE
UND
POLLENASSOZIIERTE
NAHRUNGSMITTELALLERGIE
.
3
1.1.5
HASELNUSSALLERGIE
.
6
1.1.6
PROBLEM
DER
VERSTECKTEN
ALLERGENE
IN
LEBENSMITTELN
.
7
1.2
ZIELSETZUNG
.
8
2
MATERIAL
.
10
2.1
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
10
2.2
POLLEN
.
13
2.3
REKOMBINANTE
ALLERGENE
.
13
2.4
NACHWEISANTIKOERPER
.
13
2.5
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
.
14
2.6
DNA-MARKER
.
14
2.7
OLIGONUKLEOTIDE
.
15
2.8 VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
15
2.9
BAKTERIENSTAEMME
.
16
2.10
ANTIBIOTIKALOESUNGEN
.
16
2.11
MEDIEN
FUER
DIE
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
.
16
3
METHODEN
.
17
3.1
PROTEINCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
17
3.1.1
EXTRAKTE
.
17
3.1.1.1
HERSTELLUNG
VON
HASELNUSSEXTRAKTEN
.
17
3.1.1.2
HERSTELLUNG
VON
POLLENEXTRAKTEN
.
18
3.1.1.3
PROTEINBESTIMMUNG
.
18
3.1.2
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNMETHODEN
.
18
3.1.2.1
SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
NACH
LAEMMLI
.
18
3.1.2.2
TRICIN-SDS-PAGE
NACH
SCHAEGGER
UND
VON
JAGOW
.
20
3.1.2.3
MODIFIZIERTE
TRICIN-SDS-PAGE
NACH
WESTERMEIER
.
22
3.1.2.4
GELELEKTROPHORESE
FUER
NIEDERMOLEKULARE
PROTEINE
MIT
NUPAGEYY
BIS-TRIS
FERTIGGELEN
.
24
3.1.2.5
2D-ELEKTROPHORESE
.
25
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.2.5.1
2-DIMENSIONALE
PAGE
.
25
3.1.2.5.2
OPTIMIERUNG
DER
2-DIMENSIONALEN
PAGE
.
29
3.1.3
PROTEINFAERBUNGEN
.
30
3.1.3.1
COOMASSIEFAERBUNG
.
30
3.1.3.2
SILBERFAERBUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
31
3.1.4
TRANSFERTECHNIKEN
.
32
3.1.4.1
SEMI-DRY-BLOTTING
.
32
3.1.4.2
TANKBLOTTING
DER
NUPAGEYY-BIS-TRIS
FERTIGGELE
.
33
3.1.4.3
BLOTTING
FUER
DIE
PROTEINSEQUENZIERUNG
.
34
3.1.5
ANFAERBUNG
VON
IMMOBILISIERTEN
PROTEINEN
AUF
TRANSFERMEMBRANEN
.
34
3.1.5.1
INDIA
INK-FAERBUNG
AUF
NC-MEMBRANEN
.
34
3.1.5.2
COOMASSIEFAERBUNG
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
.
34
3.1.6
IMMUNENZYMATISCHER
NACHWEIS
VON
ANTIKOERPERREAKTIVITAETEN
.
35
3.1.6.1
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
NC-MEMBRANEN
.
35
3.1.6.2
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
.
36
3.1.6.3
WESTEMBLOT-INHIBITIONSTEST
.
36
3.1.6.4
BESTIMMUNG
VON
ALLERGENSPEZIFISCHEM
IGE
MITTELS
EAST
.
37
3.1.6.5
EAST-INHIBITION
.
38
3.1.7
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
39
3.1.8
N-TERMINALE
MIKROSEQUENZIERUNG
.
39
3.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
40
3.2.1
EXTRAKTION
VON
GESAMT-RNA
AUS
HASELNUESSEN
.
40
3.2.2
SYNTHESE
VON
EINZELSTRANG-CDNA
.
40
3.2.3
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
41
3.2.4
PLASMIDPRAEPARATION
.
42
3.2.5
RNA
UND
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
43
3.2.6
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
43
3.2.7
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
43
3.2.8
KLONIERUNG
UNBEKANNTER
CDNA-SEQUENZEN
.
44
3.2.8.1
YYRAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
"
(5'-RACE)
.
44
3.2.8.2
VERLAENGERUNG
DER
CDNA
UM
SEQUENZEN
FUER
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
.
46
3.2.9
ENZYMATISCHE
HYDROLYSE
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
47
3.2.10
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
48
3.2.10.1
TA-CLONING
VON
PCR-FRAGMENTEN.
48
3.2.10.2
LIGATION
IN
DEN
PET-16B
VEKTOR
.
49
3.2.11
TRANSFORMATION
.
50
3.2.11.1
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
COZZ-ZELLEN
.
50
3.2.11.2
HERSTELLUNG
CACH-KOMPETENTER
E.
COLI-ZTWEN
.
50
3.2.11.3
TRANSFORMATION
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
50
3.2.11.4
TRANSFORMATION
MITTELS
YYHITZESCHOCK
"
.
51
3.2.12
SELEKTION
POSITIVER
TRANSFORMANDEN
.
52
3.2.12.1
BLAU-WEISS-SELEKTION
.
52
3.2.12.2
PCR-SCREENING
.
52
3.2.12.3
RESTRIKTION
.
53
3.2.13
SEQUENZIERUNG
VON
DSDNA
.
53
3.2.14
PROTEINEXPRESSION
UND
REINIGUNG
.
55
3.2.14.1
EXPRESSION
IM
PET-16B
SYSTEM
.
55
3.2.14.2
INDUKTION
DER
PROTEINSYNTHESE
.
55
II
3.2.14.3
REINIGUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
MITTELS
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
56
3.2.14.4
FAKTOR
XA-SPALTUNG
DES
FUSIONSANTEILS
.
57
3.2.15
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
.
57
3.2.15.1
KURZZEITKULTUREN
.
57
3.2.15.2
LANGZEITKULTUREN
.
58
3.3
KLINISCHE
DATEN
.
58
3.3.1
PATIENTENSEREN
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
BIRKENPOLLENASSOZIIERTEN
HASELNUSSALLERGIE
.
58
3.3.2
PATIENTENSEREN
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
BIRKENPOLLENUNABHAENGIGEN
HASELNUSSALLERGIE
.
60
4
ERGEBNISSE
.
62
4.1
NACHWEIS
IGE-BINDENDER
HASELNUSSPROTEINE
BEI
PATIENTEN
MIT
BIRKENPOLLENASSOZIIERTER
HASELNUSSALLERGIE
.
62
4.2
ANALYSE
IGE-BINDENDER
HASELNUSSPROTEINE
BEI
PATIENTEN
MIT
BIRKENPOLLENUNABHAENGIGER
HASELNUSSALLERGIE
.
64
4.3
OPTIMIERUNG
DER
ID-ELEKTROPHORESE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
NIEDERMOLEKULARER
HASELNUSSALLERGENE
.
66
4.3.1
TRICIN-SDS-PAGE
NACH
SCHAEGGER
UND
VON
JAGOW
.
66
4.3.2
MODIFIZIERTE
TRICIN-SDS-PAGE
NACH
WESTERMEIER
.
67
4.3.3
NUPAGEYY-BIS-TRIS
ELEKTROPHORESE
.
68
4.4
OPTIMIERUNG
DER
BINDUNGSKAPAZITAET
NIEDERMOLEKULARER
PROTEINE
AN
MEMBRANEN
.
69
4.5
OPTIMIERUNG
DER
2D-ELEKTROPHORESE
FUER
NIEDERMOLEKULARE
PROTEINE
.
70
4.5.1
TRENNUNGSPROBLEMATIK
IM
NIEDERMOLEKULAREN
BEREICH
.
71
4.5.2
MODIFIZIERUNG
DER
PROBENVORBEREITUNG
.
72
4.5.2.1
EXTRAKTION
DES
HASELNUSSEXTRAKTES
MIT
DIACETONALKOHOL
.
72
4.5.2.2
TCA-FAELLUNG
DER
HASELNUSSPROTEINE
.
73
4.5.2.3
PHENOLEXTRAKTION
DES
HASELNUSSEXTRAKTES
.
73
4.5.3
UEBERPRUEFUNG
DES
GELSYSTEMS
UND
ZUGESETZTER
ADDITIVA
DER
2D-ELEKTROPHORESE
.
73
4.5.3.1
ID-KONTROLLE
DER
NUPAGEYY-BIS-TRIS
GELE
.
73
4.5.3.2
VORLAUF
DER
NUPAGEYY-BIS-TRIS
GELE
IN
DER
2.
DIMENSION
.
74
4.5.3.3
2D-LAUF
MIT
REHYDRATISIERTEN
IPG-STREIFEN
OHNE
HASELNUSSPROTEIN
.
74
4.5.3.4
2D-LAUF
MIT
REHYDRATISIERTEN
UND
MIT
HASELNUSSPROTEIN
FOKUSSIERTEN
IPG-STREIFEN
UNTER
ZUSATZ
VON
AMPHOLYTEN
.
74
4.5.3.5
2D-LAUF
MIT
REHYDRATISIERTEN
UND
MIT
HASELNUSSPROTEIN
FOKUSSIERTEN
IPG-STREIFEN
OHNE
ZUSATZ
VON
AMPHOLYTEN
.
75
4.5.3.6 EINFLUSS
VON
IMMOBILINEN
.
75
4.5.4
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
AUS
2D-IMMUNOBLOT
.
76
4.6
CHARAKTERISIERUNG
NICHT-BIRKENPOLLENASSOZIIERTER
HASELNUSSALLERGENE
.
78
4.6.1
IMMUNOBLOTUNTERSUCHUNGEN
ZUR
KREUZREAKTIVITAET
GEGEN
BIRKENPOLLEN
.
78
III
INHALTSVERZEICHNIS
4.6.2
EAST-INHIBITIONSVERSUCHE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
KREUZREAKTIVITAET
GEGEN
BIRKENPOLLEN
UND
ANALYSE
DER
HITZESTABILITAET
.
79
4.6.3
NACHWEIS
NICHT-BIRKENPOLLENASSOZIIERTER
HASELNUSSALLERGENE
IN
NATIVEM
UND
GEROESTETEM
HASELNUSSEXTRAKT
MITTELS
IMMUNOBLOTTING
.
82
4.7
ANREICHERUNG
NIEDERMOLEKULARER
HASELNUSSPROTEINE
UEBER
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
84
4.7.1
ANREICHERUNG
NIEDERMOLEKULARER
HASELNUSSPROTEINE
MITTELS
DEAE-SEPHAROSEYY
.85
4.7.2
PROTEINSEQUENZIERUNG
DER
ANGEREICHERTEN
NIEDERMOLEKULAREN
HASELNUSSPROTEINE
.
8
5
4.8
AUSWERTUNG
DER
ERHALTENEN
N-TERMINALEN
SEQUENZDATEN
.
86
4.9
ANALYSE
NIEDERMOLEKULARER
ALLERGENE
BEI
PATIENTEN
MIT
NICHT
BIRKENPOLLENASSOZIIERTER
HASELNUSSALLERGIE
UND
ANAPHYLAXIE
.
87
4.10
KLONIERUNG
DES
LIPIDTRANSFERPROTEINS
(LTP)
ALS
POTENTIELLES,
NICHT
BIRKENPOLLENASSOZIIERTES
HASELNUSSALLERGEN
.
88
4.10.1
STRATEGIE
ZUR
ERMITTLUNG
DER
CDNA-SEQUENZ
DES
HASELNUSS-LTP
.
88
4.10.2
RNA-EXTRAKTION
AUS
HASELNUESSEN
.
91
4.10.3
CDNA-SYNTHESE
AUS
HASELNUSS-RNA
.
91
4.10.4
PARTIELLE
KLONIERUNG
DES
LTP
.
92
4.10.5
5'-RACE
ZUR
ERMITTLUNG
DES
5'-ENDES
DER
LTP-CDNA
.
93
4.10.6 KLONIERUNG
DER
LTP-KODIERENDEN
CDNA
.
94
4.11
HERSTELLUNG
DES
REKOMBINANTEN
COR
A
8
.
96
4.11.1
KLONIERUNG
VON
COR
A
8
IN
DEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PET
1
6B
.
96
4.11.2
EXPRESSION
DES
REKOMBINANTEN
COR
A
8
.
96
4.11.3
REINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
FUSIONSPROTEINS
.
:
.
99
4.11.4
ABSPALTUNG
DES
FUSIONSANTEILS
.
100
4.12
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZDATEN
.
101
4.12.1
AMINOSAEURESEQUENZVERGLEICH
VON
COR
A
8
MIT
VERWANDTEN
PROTEINEN
.
101
4.12.2 WEITERE
COMPUTERGESTUETZTE
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZDATEN
.
102
4.13
CHARAKTERISIERUNG
DES
COR
A
8
.
102
4.13.1
UNTERSUCHUNG
DER
IGE-PRAEVALENZ
BEI
SPANISCHEN
UND
DEUTSCHEN
HASELNUSSALLERGIKEM
MITTELS
IMMUNOBLOT
UND
EAST
.
102
4.13.2 UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
REKOMBINANTEN
COR
A
8
MITTELS
IMMUNOBLOT-INHIBITION
.
104
4.13.3
UNTERSUCHUNG
VON
COR
A
8-HOMOLOGEN
ALLERGENEN
IN
POLLENEXTRAKTEN
MITTELS
IMMUNOBLOT
UND
EAST-INHIBITION
.
105
5
DISKUSSION
.
108
5.1
OPTIMIERUNG
PROTEINCHEMISCHER
METHODEN
ZUR
DARSTELLUNG
NIEDER
MOLEKULARER
HASELNUSSALLERGENE
109
5.1.1
ID-ELEKTROPHORESE
.
109
5.1.2
2D-ELEKTROPHORESE
.
110
5.1.3
IMMUNOBLOTTECHNIK.
112
IV
5.2
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
BIRKENPOLLENUNABHAENGIGER
HASELNUSSALLERGENE
.
113
5.2.1
IGE-REAKTIVITAET
BEI
BIRKENPOLLENABHAENGIGER
HASELNUSSALLERGIE
.
114
5.2.2
IGE-REAKTIVITAET
BEI
BIRKENPOLLENUNABHAENGIGER
HASELNUSSALLERGIE
.
116
5.2.2.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KREUZREAKTIVITAET
MITTELS
IMMUNOBLOT
UND
EAST
INHIBITIONSANALYSEN
.
116
5.2.2.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
HITZESTABILITAET
.
117
5.2.2.3
IGE-REAKTIVITAET
IM
WESTEMBLOT
.
118
5.3
ANREICHERUNG
NIEDERMOLEKULARER
HASELNUSSALLERGENE
UND
AUSWERTUNG
DER
ERHALTENEN
N-TERMINALEN
SEQUENZDATEN
.
119
5.4
KLONIERUNG
DES
LIPIDTRANSFERPROTEINS
(LTP)
DER
HASELNUSS
.
120
5.4.1
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA,
REVERSE
TRANSKRIPTION,
POLYMERASE-
KETTENREAKTION
(PCR),
5
'-RACE
.
120
5.4.2
SEQUENZDATEN
DES
HASELNUSS-LTP
.
122
5.4.3
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
LTP
.
122
5.5
CHARAKTERISIERUNG
DES
LIPIDTRANSFERPROTEINS
DER
HASELNUSS
.
123
5.5.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
SPEZIFITAET
VON
REKOMBINANTEM
COR
A8
.
123
5.5.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
IGE-PRAEVALENZ
VON
REKOMBINANTEM
COR
A
8
.
124
5.5.3
UNTERSUCHUNGEN
ZU
COR
A
8-HOMOLOGEN
ALLERGENEN
IN
POLLEN
.
127
6
AUSBLICK
.
129
7
ZUSAMMENFASSUNG
.
130
8
SUMMARY
.
132
9
LITERATURVERZEICHNIS
.
134
PUBLIKATIONEN
LEBENSLAUF
V |
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