Molekulare Analyse der Yersinien-Wirtszell-Interaktion:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG .1
1.1 DIE GATTUNG
YERSINIA UND IHRE HUMANMEDIZINISCHE BEDEUTUNG.
1
1.2 GRUNDLAGEN DER PATHOGENITAET VON
YERSINIEN.-.-. 3
1.3 DIE YOP
EFFEKTOR-PROTEINE.-.
4
1.4 ZIELE DER VORLIEGENDEN ARBEIT.-.7
2 MATERIAL UND METHODEN.8
2.1
MATERIAL.M.M.M.
M. 8
2.1.1 GERAETE. 8
2.1.2 CHEMIKALIEN.9
2.1.3 KITSYSTEME.11
2.1.4 ANTIKOERPER.11
2.1.5 NAEHRMEDIEN. 12
2.1.6 PLASMIDE. 14
2.1.7 STAEMME. 16
2.1.8 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE.17
2.2 METHODEN.18
2.2.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN. 18
2.2.1.1 ANZUCHTBEDINGUNGEN VON BAKTERIEN UND HEFEN.18
2.2.1.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON BAKTERIEN- UND HEFEKULTUREN.19
2.2.1.3 AUSPLATTIEREN VON BAKTERIEN UND HEFEN.19
2.2.1.4 LAGERUNG VON BAKTERIEN UND HEFEN.19
2.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.19
2.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN.19
2.2.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS HEFEN.20
2.2.2.3 PHOTOMETRISCHE DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.21
2.2.2.4 RESTRIKTIONSVERDAU.'.21
2.2.2.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA.21
2.2.2.6 ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS EINEM AGAROSEGEL.22
2.2.21 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN (58).22
2.2.2.8 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN UND TRANSFORMATION.23
2.2.2.9 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) (59). 23
2.2.2.10 DNA-SEQUENZIERUNG (74). 24
2.2.3 DAS YEAST TWO-HYBRID SYSTEM.25
2.2.3.1 TESTS AUF AUTOAKTIVIERUNG DER REPORTER.28
2.2.3.2 PRUEFUNG AUF DIE KEMGAENGIGKEIT UND BINDUNG AN LEXA OPERATOREN.28
2.2.3.3 HEFEZELLTRANSFORMATION.30
2.2.3.4 TRANSFORMATION DER GENBANK.30
2.2.3.5 FILTERASSAY AUF SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET.31
2.2.3.6 TEST AUF AKTIVIERUNG DES LEU-REPORTERGENS.31
2.23.7 HEFE-PAARUNGSTEST (MATING-TEST).32
2.2.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.32
2.2.4.1 PROTEINISOLATION AUS HEFEZELLEN.32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/964558785
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.4.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD (14).33
2.2.4.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (53).33
2.2.4.4 WESTEMBLOT / IMMUNOBLOT.34
2.2.4.5 KOIMMUNOPRAEZIPITATION (65).35
2.2.5 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN.36
2.2.5.1 KULTIVIERUNG VON HUMANEN ZELLINIEN.36
2.2.5.2 INFEKTION VON ZELL-LINIEN MIT YERSINIEN.36
3 ERGEBNISSE.37
3.1 UNTERSUCHUNG VON YOPM UND YOPO/YPKA IM YEAST TWO-HYBRID SYSTEM.
37
3.1.1 YOPM.37
3.1.1.1 KLONIERUNG.I.37
3.1.1.2 SEQUENZIERUNG.37
3.1.1.3 AUTOAKTIVIERUNGSVERSUCHE.38
3.1.2 DAS YOPM-FRAGMENT (YOPM-F).41
3.1.2.1 KLONIERUNG DES YOPM-FRAGMENTES.41
3.1.2.2 SEQUENZIERUNG DES YOPM-FRAGMENTES.41
3.1.2.3 AUTOAKTIVIERUNGSVERSUCHE.41
3.1.3 YOPO .42
3.1.3.1 KLONIERUNG. 42
3.1.3.2 SEQUENZIERUNG. 42
3.1.3.3 AUTOAKTIVIERUNGSVERSUCHE.43
3.1.3.4 REPRESSIONSASSAY.44
3.1.3.5 GENBANKTRANSFORMATION.46
3.1.3.6 SELEKTIONSVERFAHREN.47
3.1.3.7 HEFEPAARUNGSTESTE. 48
3.1.3.8 IDENTIFIZIERUNG DER POSITIVEN KLONE.48
3.2 PRUEFUNG AUF INTERAKTION VON WEITEREN MITGLIEDERN DER RHO-FAMILIE MIT
YOPO /
YPKA IM YEAST TWO-HYBRID SYSTEM.52
3.2.1 KLONIERUNG VON RACL, RHOA, CDC42 UND RACL V12 IN DEN ZIELVEKTOR
PJG4-5.53
3.2.2 KLONIERUNG VON YPKA UND AYPKA IN DEN KOEDERVEKTOR PEG202.54
3.2.3 HEFEPAARUNGSTEST VON MITGLIEDERN DER RHO-FAMILIE MIT YOPO, YPKA
UND
AYPKA . 55
3.2.4 UEBERPRUEFUNG DER EXPRESSION DER ZIELPROTEINE MIT EINEM
IMMUNOBLOT.57
3.3 KOIMMUNOPRAEZIPITATION VON RHOA UND RACL AUS INFIZIERTEN COS - ZELLEN
. 60
4 DISKUSSION.63
/
4.1 YOPM. 63
4.2 YOPO/YPKA_-----64
4.3 DAS ERGEBNIS DER YEAST TWO-HYBRID
FILTER-UNTERSUCHUNG. 65
4.4 KOIMMUNOPRAEZIPITATION VON RACL UND RHOA MIT ANTI-YPKA ANTIKOERPERN
AUS
INFIZIERTEN COS-ZELLEN. 69
4.5 BIOLOGISCHE RELEVANZ DER INTERAKTION ZWISCHEN YPKA/YOPO UND RHOA
BZW.
RACL _71
INHALTSVERZEICHNIS
5 ZUSAMMENFASSUNG. 74
6 ABKUERZUNGEN.75
7 LITERATURVERZEICHNIS. 77 |
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