Klonierung, rekombinante Herstellung und Charakterisierung von humanen Mastzell-Tryptasen:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 EINLEITUNG 3
2.1 DIE IMMUNOLOGISCHE BEDEUTUNG DER MASTZELLE 3
2.2 MASTZELL TRYPTASE 4
2.2.1 PHYSIOLOGISCHE UND PATHOPHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN DER TRYPTASE 4
2.2.2 DIE TRYPTASESTRUKTUR ERKLAERT VIELE BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN DES
ENZYMS 5
2.2.3 REGULATION DER TRYPTASEAKTIVITAET ' 6
2.3 TRYPTASEINHIBITOREN 7
2.4 TRYPTASE ISOENZYME 7
2.5 AUFGABENSTELLUNG 10
3 MATERIALIEN UND METHODEN 11
3.1 MATERIALIEN 11
3.1.1 GERAETE 11
3.1.1.1 GERAETE FUER MIKROBIOLOGISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 11
3.1.1.2 GERAETE FUER BIOCHEMISCHE UND PROTEINCHEMISCHE ARBEITEN 11
3.1.1.3 GERAETE FUER DIE FERMENTATION 11
3.1.1.4 SONSTIGE GERAETE 12
3.1.2 SUBSTANZEN UND MATERIALIEN 12
3.1.2.1 CHROMATOGRAPHIEMEDIEN UND -SAEULEN 12
3.1.2.2 MATERIALIEN FUER DIE PROTEINANALYTIK 12
3.1.2.3 MATERIALIEN FUER ENZYMTESTS UND KINETISCHE MESSUNGEN 13
3.1.2.4 MATERIALIEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 14
3.1.2.5 SONSTIGE MATERIALIEN 15
3.1.3 BAKTERIEN-UND HEFESTAEMME SOWIE PLASMIDE 16
3.1.4 OLIGONUKLEOTIDE 19
3.1.4.1 ERST-STRANG CDNA-SYNTHESE PRIMER 19
3.1.4.2 PCR-PRIMER 20
3.1.4.3 SEQUENZIERPRIMER 21
3.2 METHODEN 21
3.2.1 KLONIERUNG DER TRYPTASE-ISOENZYME AUS HMC 1-UND MM6-ZELLEN 21
3.2.1.1 RNA-ISOLIENMG NACH CHOMCZYNSKI 22
3.2.1.2 ERSTSTRANG-CDNA-SYNTHESE 22
3.2.1.3 PCR MIT SPEZIFISCHEN TRYPTASE-PRIMEM 22
3.2.2 EXPRESSION DER TRYPTASEN IN
E. COLI ' 25
3.2.3 ZELLEMTE UND ISOLIERUNG DER EINSCHLUSSKOERPERCHEN 25
3.2.4 RUECKFALTUNG DER REKOMBINANTEN TRX-PRO-TRYPTASEN 26
3.2.5 EXPRESSION DER TRYPTASEN IN
PICHIA PASTORIS IM SCHUETTELKOLBEN 27
3.2.6 EXPRESSION DER TRYPTASEN IN
PICHIA PASTORIS IM FERMENTER 27
3.2.6.1 ANZUCHT DER VORKULTUR 28
3.2.6.2 STERILISATION DES MEDIUMS UND ANIMPFEN DES FERMENTERS 28
3.2.6.3 FERMENTATION 28
3.2.6.4 ZELLEMTE UND AUFKONZENTRIERUNG DES MEDIUMS 29
3.2.7 REINIGUNG DER TRYPTASE-ISOENZYME MITTELS
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE 30
3.2.8 PROTEINCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TRYPTASE-ISOENZYME 30
3.2.8.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 30
3.2.8.2 FAERBUNG VON POLYACRYLAMID-GELEN MIT
COOMASSIE BRILLIANT BLAU 32
3.2.8.3 WESTERN BLOT ANALYSE 32
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/964461528
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.8.4 N-TERMINALE AMINOSAEURESEQUENZIERUNG 33
3.2.8.5 .PEPTIDE MAP
1 34
3.2.8.6 DEGLYCOSYLIERUNG DER TRYPTASE-ISOENZYME 34
3.2.8.7 CD-SPEKTREN UND SCHMELZPUNKTBESTIMMUNG 34
3.2.8.8 STABILITAETSMESSUNG DES TRYPTASE-TETRAMERS 35
3.2.9 ENZYMKINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TRYPTASE-ISOENZYME 36
3.2.9.1 YYACTIVE SITE"-TITRATION 36
3.2.9.2 BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAET 37
3.2.9.3 BESTIMMUNG DER ENZYMKINETISCHEN KENNGROESSEN (KM, KCA,. UND
K^A/KM) 37
3.2.9.4 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE KF DES
ENZYM-INIBITOR-KOMPLEXES 39
3.2.10 TRENNUNG DER .TRYPTASE-SPEZIES" 43
3.2.11 ALLGEMEINE MIKROBIOLOGISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 43
3.2.11.1 STAMMHALTUNG VON E. CO/I-STAEMMEN 43
3.2.11.2 STAMMHALTUNG VON
PICHIA PASTORIS-STAEMMEN 43
3.2.11.3 ANZUCHT UND VERMEHRUNG VON
E. CO/I'-STAEMMEN 44
3.2.11.4 ANZUCHT UND VERMEHRUNG VON
PICHIAPASTORIS-STAEMMEN 44
3.2.11.5 MEDIEN UND ANTIBIOTKA 44
3.2.11.6 ISOLIERUNG VON DNA 45
3.2.11.7 QUANTIFIZIERUNG VON DNA UND RNA 46
3.2.11.8 LN
VITRO-ARBEITEN MIT DNA 47
3.2.11.9 TRANSFORMATION MITTELS ELEKTROPORATION 50
4 ERGEBNISSE 52
4.1 KLONIERUNG DER CDNAS DER TRYPTASE-ISOENZYME 52
4.1.1 PCR-AMPLIFIKATION DER TRYPTASE-CDNAS AUS MM6- BZW. HMC 1-ZELLEN 52
4.1.2 LIGATION DER PCR-FRAGMENTE UND TRANSFORMATION VON E. COLI 53
4.1.3 WEITERE TRYPTASE-ISOENZYME 56
4.2 EXPRESSION DER TRYPTASE-ZYMOGENE IN
E. COLI ALS THIOREDOXIN-FUSIONSPROTEINE 56
4.2.1 KONSTRUKTION DER PLASMIDVEKTOREN UND KLONIERUNG IN E. COLI 56
4.2.2 EXPRESSION UND REINIGUNG DER THIOREDOXIN-FUSIONSPROTEINE 57
4.2.3 RUECKFALTUNG DER TRX-SSLB-PRO-TRYPTASE UND DEREN PROZESSIERUNG
IN VITRO 58
4.2.4 ASSEMBLIERUNG DES ENZYMATISCH AKTIVEN TRYPTASE-TETRAMERS 60
4.3 EXPRESSION DER TRYPTASE-ISOENZYME IN
PICHIA PASTORIS 61
4.3.1 KONSTRUKTION DER HEFEVEKTOREN 61
4.3.2 TRANSFORMATION VON
PICHIA PASTORIS UND SELEKTION VON KLONEN 62
4.3.3 EXPRESSION IM SCHUETTELKOLBEN 63
4.3.4 FERMENTATION 63
4.3.5 REINIGUNG 67
4.3.5.1 KONZENTRATION UND FILTRATION 67
4.3.5.2 KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 68
4.3.5.3 VERGLEICH DER REINIGUNG DER ISOENZYME 70
4.4 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG 71
4.4.1 SDS-POLYACRYAMID GELELEKTROPHORESE 71
4.4.2 DEGLYCOSILIERUNG 72
4.4.3 N-TERMINALE AMINOSAEURESEQUENZIERUNG UND .PEPTIDE MAP" 73
4.5 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG 76
4.5.1 SPEZIFISCHE AKTIVITAET DER SS-ISOENZYME 77
4.5.2 BESTIMMUNG DER KINETISCHEN KENNGROESSEN 78
4.5.3 STABILITAET DER ISOENZYME 80
4.5.3.1 STABILITAET IN DER ABWESENHEIT VON HEPARIN 80
4.5.3.2 TETRAMER-STABILITAET IN DER GEGENWART VON HEPARIN 84
4.5.3.3 STABILISIERUNG DES TETRAMERS DURCH INHIBITOREN 86
4.5.4 HEMMKINETISCHE CHARAKTERISIERUNG 88
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.6 ,TRYPTASE-SPEZIES
1 92
4.6.1 TRENNUNG DER .TRYPTASE-SPEZIES' 92
4.6.2 HEMMKINETIK MIT BIVALENTEN INHIBITOREN 94
4.7 STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG 96
4.7.1 AL-TRYPTASE 98
4.7.2 SS3-TRYPTASE/NS-222-KOMPLEX 99
4.7.3 KOMPLEX VON SSLA-TRYPTASE MIT BYK-76935. 100
4.7.4 KOMPLEX VON SS3-TRYPTASE MIT BYK-150640 101
5 DISKUSSION 103
5.1 BEDEUTUNG DER TRYPTASE ISOENZYME 103
5.2 KLONIERUNG DER AL- UND SSLB-TRYPTASE 103
5.3 EXPRESSION DER ZYMOGENE IN
E. COLI 104
5.4 RUECKFALTUNG UND PROZESSIERUNG DER ZYMOGENE 104
5.5 EXPRESSION DER TRYPTASEN IN
PICHIA PASTORIS 105
\
5.6 REINIGUNG 106
5.7 TRYPTASE GLYKOFORMEN 107
5.8 STABILITAET DER ISOENZYME 108
5.9 KRISTALLSTRUKTUR DES AL-TRYPTASE-TETRAMERS 112
5.10 KINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ISOENZYME 113
5.10.1 AL-TRYPTASE 113
5.10.2 SS-TRYPTASEN 113
5.11 HEMMKINETISCHE CHARAKTERISIERUNG 114
5.12 BIVALENT BINDENDE INHIBITOREN 115
1
5.13 TRYPTASE SPEZIES 119
5.13.1 TRENNUNG DER TRYPTASE-SPEZIES* 119
5.13.2 CHARAKTERISIERUNG DER TRYPTASE-SPEZIES MIT INHIBITOREN 121
5.14 AUSBLICK 123
6 LITERATURVERZEICHNIS 124
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