Das mitochondriale Fusionsprotein Fzo1: potentielle Interaktionspartner und Bedeutung für die mitochondriale Morphologie
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
_
1
1.1
M
ITOCHONDRIEN
1
1.2
M
ORPHOLOGIE
,
L
OKALISATION
UND
T
RANSPORT
VON
M
ITOCHONDRIEN
2
1.2.1
M
ORPHOLOGIE
UND
L
OKALISATION
2
1.2.2
T
RANSPORT
VON
M
ITOCHONDRIEN
IN
DER
Z
ELLE
UND
V
ERERBUNG
3
1.2.3
Z
USAMMENHANG
ZWISCHEN
MITOCHONDRIALER
M
ORPHOLOGIE
UND
MITOCHONDRIALER
DNA
4
1.2.4
B
ETEILIGTE
P
ROTEINE
4
1.3
F
USION
VON
M
ITOCHONDRIEN
/FZOI
5
1.3.1
H
INWEISE
AUF
MITOCHONDRIALE
F
USION
5
1.3.2
B
ESONDERHEIT
DER
MITOCHONDRIALEN
F
USION
5
1.3.3
B
EOBACHTUNGIMPHASENKONTRASTMIKROSKOP
5
1.3.4
B
EOBACHTUNG
IM
E
LEKTRONENMIKROSKOP
6
1.3.5
D
AS
F
ZO
-P
ROTEIN
BEI
D
ROSOPHILA
MELANOGASTER
6
1.3.6
D
AS
F
ZO
-P
ROTEIN
BEI
S
ACCHAROMYCES
CEREVISIAE
7
1.4
F
RAGESTELLUNG
UND
Z
IELSETZUNG
7
2
MATERIAL
UND
METHODEN
_
9
2.1
M
ETHODEN
DER
M
OLEKULARBIOLOGIE
9
2.1.1
P
RAEPARATION
VON
DNA
9
2.1.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
9
2.1.1.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
10
2.1.1.3
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA MITTELS
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
11
2.1.2
E
NZYMATISCHE
M
ODIFIKATION
VON
DNA
11
2.1.2.1
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
11
2.1.2.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
12
2.1.2.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4-LIGASE
12
2.1.2.4
TA-KLONIERUNG
12
2.1.3
R
EINIGUNG
UND
A
NALYSE
VON
DNA
12
2.1.3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
12
2.1.3.2
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
13
2.1.3.3
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
13
2.1.3.4
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
13
2.1.3.5
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
13
2.1.4
T
RANSFORMATION
VON
M
IKROORGANISMEN
MIT
REKOMBINANTER
DNA
14
2.1.4.1
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
PLASMID-DNA
14
2.1.4.2
TRANSFORMATION
VON
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
MIT
REKOMBINANTER
DNA
14
2.1.5
T
EST
AUF
SS-GALAKTOSIDASE
A
KTIVITAET
15
2.2
M
ETHODEN
DER
H
EFEGENETIK
15
2.2.1
K
ULTIVIERUNG
VON
S
ACCHAROMYCES
CEREVISIAE
15
2.2.2
K
REUZUNG
VON
S
ACCHAROMYCES
CEREVISIAE
16
2.2.3
T
ETRADENANALYSE
17
23
P
ROTEINBIOCHEMIE
UND
I
MMUNOLOGIE
17
2.3.1
G
EWINNUNG
VON
G
ESAMTZELLPROTEIN
AUS
H
EFE
17
2.3.2
F
AELLUNG
VON
P
ROTEINEN
17
2.3.3
B
ESTIMMUNG
DER
P
ROTEINKONZENTRATION
MIT
T
RICHLORESSIGSAEURE
(TCA)
18
2.3.4
SDS-P
OLY
ACRYLAMID
-G
ELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
18
2.3.5
T
RANSFER
ELEKTROPHORETISCH
AUFGETRENNTER
P
ROTEINE
AUF
N
ITROZELLULOSE
(W
ESTERN
-B
LOT
)
18
2.3.6
I
MMUNOLOGISCHER
N
ACHWEIS
IMMOBILISIERTER
P
ROTEINE
AUF
N
ITROZELLULOSE
19
2.4
P
HASENKONTRAST
-
UND
F
LUORESZENZMIKROSKOPIE
19
2.4.1
V
ORBEREITUNG
DER
H
EFEZELLEN
19
2.4.2
S
ICHTBARMACHEN
DER
M
ITOCHONDRIEN
IN
H
EFEZELLEN
19
2.5
G
ERAETE
,
C
HEMIKALIEN
,
E
NZYME
20
2.5.1
G
ERAETE
20
2.5.2
C
HEMIKALIEN
UND
E
NZYME
20
3
ERGEBNISSE
22
3.1
P
ROTEINSEQUENZ
UND
D
OMAENEN
DES
FZOL
BEI
S
ACCHAROMYCES
CEREVISIAE
22
3.2
MULTICOPY-SUPPRESSOR-SCREEN
23
3.2.1
I
DEE
DES
M
ULTICOPY
-S
UPPRESSOR
-S
CREENS
23
3.2.2
AUFBAUDES
M
ULTICOPY
-S
UPPRESSOR
-S
CREENS
24
3.2.3
D
URCHFUEHRUNG
DES
M
ULTICOPY
-S
UPPRESSOR
-S
CREENS
25
3.2.4
A
NALYSE
DER
K
ANDIDATEN
26
3.2.5
SCHLUSSFOLGERUNG
AUS
DEM
MULTICOPY-SUPPRESSOR-SCREEN
27
33
Y
EAST
-T
WO
-H
YBRID
-S
YSTEM
27
3.3.1
I
DEE
DES
Y
EAST
-T
WO
-H
YBRID
-S
YSTEMS
27
3.3.2
A
UFBAU
DES
Y
EAST
-T
WO
-H
YBRID
-S
YSTEMS
29
3.3.3
D
URCHFUEHRUNG
DES
Y
EAST
-T
WO
-H
YBRID
MIT
EINER
G
ENBIBLIOTHEK
30
3.3.3.1
TRANSFORMATION
UND
SELEKTION
AUF
DIE
REPORTERGENE
31
3.3.3.2
TESTS
ZUR
ELIMINATION
FALSCH
POSITIVER
KANDIDATEN
32
3.3.3.3
ANALYSE
VON
KANDIDATEN
AUS
DEM
TWO-HYBRID-SCREEN
33
3.3.4
D
URCHFUEHRUNG
DES
YEAST
-T
WO
-H
YBRID
-S
CREENS
ZUR
U
NTERSUCHUNG
DER
I
NTERAKTION
DES
FZOL
MIT
SICH
SELBST
35
3.4
A
FZO
7-D
OPPELMUTANTEN
36
3.4.1
S
TAEMME
MIT
D
OPPELMUTATIONEN
36
3.4.2
B
EOBACHTUNGEN
37
3.4.2.1
MGM7^ZO7-DOPPELMUTANTEN
37
3.4.2.2
MDM72#ZO7-DOPPELMUTANTEN
38
3.4.2.3
_/ZO7/C/U
7
-DOPPELMUTANTEN
40
3.5
UE
BEREXPRESSION
DES
FZO1
IN
S
ACCHAROMYCES
CEREVTSIAE
40
3.5.1
P
LASMIDE
UND
S
TAEMME
40
3.5.2
M
ORPHOLOGIE
VON
FZO1
-UE
BEREXPRESSIONSMUTANTEN
45
3.5.3
W
ACHSTUM
DER
FZO1
-UE
BEREXPRESSIONSSTAEMME
46
4
DISKUSSION
_
50
4.1
FZOL
ALS
T
EIL
EINES
P
ROTEINKOMPLEXES
FUER
DIE
F
USION
50
4.1.1
AE
HNLICHKEITEN
MIT
ANDEREN
F
USIONSMOLEKUELEN
50
4.1.2
FZOL
ALS
TEIL
EINES
P
ROTEINKOMPLEXES
51
4.1.3
I
DENTIFIZIERUNG
DER
I
NTERAKTIONSPARTNER
51
4.2
FZO7-DOPPELMUTANTEN
52
4.3
UEBEREXPRESSION
DES
FZO1
IN
SACCHAROMYCES
CEREWSIAE
53
5
ZUSAMMENFASSUNG
_
55
6
LITERATUR
_
_57 |
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