SCaMPER: ein potentieller intrazellulärer Rezeptor für Sphingosylphosphocholin?
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Pentling
Saska-Verl.
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INHALTSVERZEICHNIS 3
Abkürzungen 6
1. Einleitung 9
1.1 Zur Biochemie der Lipide: Einführung der Sphingolipide 9
1.2 Struktur und Vorkommen der sphingoiden Moleküle 12
1.3 Die Niemann Picksche Erkrankung eine Sphingolipidose 16
1.4 Bedeutung der Sphingolipid Metabolite 18
1.4.1 Sphingolipid Metabolite als bioaktive Substanzen 18
1.4.2 Einflüsse auf die Kalziumhomöostase 18
1.5 Potentielle Target Moleküle für Sphingosin 1 phosphat und
Sphingosylphosphocholin 22
1.6 SCaMPER, ein mögliches intrazelluläres Target Molekül für
Sphingosylphosphocholin 25
1.6.1 Allgemeines 25
1.6.2 Molekularbiologische Daten 25
1.6.3 Funktionelle Daten 25
1.6.4 Lokalisation 27
1.7 Fragestellung und Ziel der vorliegenden Arbeit 28
2. Material und Methoden 29
2.1 Material 29
2.1.1 Antikörper 29
2.1.2 Enzyme 29
2.1.3 Verschiedene Materialien 30
2.1.4 Pufferlösungen 31
2.1.5 Zellkulturen 34
2.1.6 Angewandte Computerprogramme 35
2.2 Methoden 36
2.2.1 Zubereitung zytoplasmatischer RNA von MDCK Zellen und
KlonierungdercDNA 36
2.2.2 Polymerasekettenreaktion 38
1
2.2.3 Sequenz Analyse 39
2.2.4 Konstruktion der SCaMPER Fusionsproteine 40
2.2.4.1 Allgemeines: Restriktion von DNA 40
Dephosphorylierung von DNA 41
Ligation 4'
2.2.4.2 Klonierung des Proteins SCaMPER am N und am C Terminus 41
a) Klonierung am N Terminus 41
"HA SCaMPER" unter dem RSV LTR Promotor
"HA SCaMPER" unter dem T7 Promotor
"EGFP SCaMPER" unter dem RSV LTR Promotor
'EGFP SCaMPER" unter dem T7 Promotor
b) Klonierung am C Terminus 42
"Sca HA" unter dem T7 Promotor
"SCaMPER EGFP" unter dem T7 Promotor
2.2.4.3 Klonierung des bizistronischen Vektors mit dem T7 Promotor 43
Klonierung des bizistronischen Vektors mit dem RSV LTR Promotor 45
2.2.5 Transformation 45
2.2.6 Plasmidpräparation 45
2.2.7 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 46
2.2.8 Transiente Transfektion von BHK und MDCK Zellen 46
(Ãberexpression der Proteine mit dem T7 Polymerase vaccinia virus)
2.2.9 a) Produktion der polyklonalen Antikörper 49
b) Purifikation der polyklonalen Antikörper 49
Vorbereitung der Chromatographiesäule 49
Affinitätschromatographie 50
2.2.10 Immunofluoreszenz Experimente zur Ermittlung der Topologie und der
intrazellulären Lokalisierung von SCaMPER 51
a) Immunofluoreszenz in vitro 51
b) Immunofluoreszenz in vivo 52
2.2.11 Herstellung des rekombinanten SCaMPER Proteins in E.coli 53
2.2.12 Herstellung von Homogenisaten 53
2.2.13 SDS PAGE und Western Blot Analyse 54
4
3. Ergebnisse 55
3.1 Klonierung und Analyse der SCaMPERcDNA 55
3.2 Expression und Lokalisation des SCaMPER Proteins 61
3.2.1 Produktion von polyklonalen Antikörpern 61
3.2.2 SCaMPER Fusionsproteine 64
Die Fusion von SCaMPER am N Terminus 66
Die Fusion von SCaMPER am C Terminus 69
3.3 Morphologische Veränderungen und die durch SCaMPER Ãberexpression
induzierte Toxizität 72
4. Diskussion 76
4.1 Allgemeines zu dieser Dissertationsarbeit 76
4.2 Die Korrektion der publizierten Daten aus der Literatur 77
4.3 Die Fusionsproteine: N Terminus versus C Terminus 78
4.3.1 Der N Terminus 79
4.3.2 Der C Terminus 80
4.4 Veränderte Morphologie des "SCaMPER EGFP" 81
4.5 Lokalisierung des "SCaMPER EGFP" 81
4.6 Toxizität 82
4.7 Die proteolytische Spaltung von SCaMPER und regulierte intramembrane
Proteolyse(RIP) 83
4.7.1 Proteolytische Spaltung des Fusionsproteins "SCaMPER EGFP" 83
4.7.2 Beispiele der regulierten intramembranen Proteolyse (RIP) 84
4.7.3 Perspektiven der regulierten intramembranen Proteolyse (RIP) 85
4.8 SCaMPER. ein intrazelluläres Target Molekül für SPC? 86
5. Literatur 88
6. Zusammenfassung 96
Curriculum vitae 98
Danksagung 99 |
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