Regulation der Kontraktion in der glatten Muskulatur:: die Bedeutung der monomeren GTPase Ras und des Rho/Rho-Kinase Signalweges
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Herdecke
GCA-Verl.
2002
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| Series: | Forschen und Wissen - Physiologie
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Inhaltsverzeichnis:
Abkürzungsverzeichnis 1
I Vorwort. 3
II Einleitung 4
1. Struktur der glatten Muskulatur 4
2. Molekularer Mechanismus der Kontraktion .6
3. Signalübertragung in der glatten Muskelzelle 1
3.1 Kopplung von Erregung und Kontraktion. 7
3.2 Die Aktivierung der Kontraktion durch Ca erfolgt über die
Myosin leichte Ketten Kinase (MLCK). 8
3.2.1 Agonisten erhöhen die Ca2+ Sensitivität der Kontraktion. 9
3.2.2 Grundlage für die Ca2+ Sensitivierung ist vor allem die
Hemmung der Myosin leichte Ketten Phosphatase (MLCP). 10
3.3 Ca2+ Desensitivierung über Inaktivierung der MLCK oder
Aktivierung der MLCP 12
4. G Proteine in der intrazellulären Signaltransduktion. 13
4.1 Heterotrimere G Proteine 13
4.2 Monomere G Proteine 14
4.2.1 Das monomere G Protein Ras. 15
4.2.2 Das monomere G Protein Rho 16
5. Ziele dieser Arbeit 17
III Material und Methoden 19
1. Kraftnwssungen an glattmuskulären Präparaten 19
1.1 Herstellung der Gewebepräparate 19
1.1.2 Physiologische Salzlösung (PSS). 19
1.1.3 Präparation der Arterien .20
1.1.4 Präparation der glatten Longitudinalmuskulatur des Ileums. .20
1.2 Versuchsapparatur 21
1.3 Permeabilisierung von Muskelpräparaten .23
1.3.1 Permeabilisierung mit ß Escin .23
1.3.2 Permeabilisierung mit Triton X 100. .25
1.4 Calmodulin 26
D Inhaltsverzeichnis
2. Auftrennung von Proteingeniischen durch Gelelektrophorese 27
2.1 Isoelektrische Fokussierung (EF) .27
2.2 Denaturierende SDS Gelelektrophorese nach Laemmli (SDS
PAGEX 29
2.3 Lineare Gradientengele. 31
3. Färbungen von Proteinen in Polyacrylamidgelen .33
3.1 Coomassie Färbung 33
3.2 Silberfärbung nach Schoenle et al. (1984) 34
4. Aufbewahren von Gelen .35
5. Bestimmung der MLC20 Phosphorylierung .35
6. Western Blot .36
6.1 Transfer der Proteine 36
6.2 Färbung von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen .37
6.3 Antikörperinkubation 38
6.4 Nachweis der Immunreaktion 39
6.5 Entfernen von Antikörpern von Nitrocellulosemembranen .40
7. Bestimmung von Proteinkonzentrationen nach Bradford .40
8. Bestimmung der Thiophosphorylierung von Proteinen durch
35S Inkorporation mit [y^SJATP .41
9. Standardprotokoll für Experimente zur ATPyS induzierten
Ca^ Sensitivierong 42
10. Bestimmung von Cho Wert und Km Werten .42
11. Statistik 44
12. Bezugsquellennachweis 45
12.1 Chemikalien 45
12.2 Agonisten und Inhibitoren 46
12.3 Nucleotide. 46
12.4 Molekulargewichtsmarker ...47
12.5 Antikörper
IV Ergebnisse 48
1. Charakterisierung der glattmuskulären Präparate .48
1.1 Muskelpräparate mit intakter Zellmembran .48
1.2 Muskelpräparate mit permeabilisierter Zellmembran 52
2. Einfluß der Hemmung des monomeren G Proteins Ras durch
das Letaltoxin (LT) von Clostridium sordellii 55
Inhaltsverzeichnis in
3. Wirkung der Hemmung der Rho assoziierten Kinase (Rho
Kinase) durch Y 27632 .58
3.1 Wirkung von Y 27632 auf Präparate mit intakter Zeilmembran .58
3.2 Wirkung von Y 27632 auf mit ß Escin permeabilisierte
Präparate 61
3.3 Wirkung von Y 27632 auf mit Triton X lÖÖ behandelte
Ileummuskulatur. 64
4. Einfluß der Proteinkinase C, Vergleich zwischen glatter
Muskulatur aus Ileum und Aa. jejunales 64
4.1 Ca2+ Sensitivierung durch Phorbolester (PDBu) bei Präparaten
aus Aa. jejunales 64
4.2 Ca2+ Sensitivierung durch Phorbolester bei Präparaten aus
Ileummuskulatur 65
5. Ca^ Sensitivierung durch Thiophosphorylierung mit ATPyS 67
5.1 Einfluß des Rho kinase Inhibitors Y 27632 auf die Ca2+
Sensitivierung durch ATPyS 68
5.2 Hemmung des G Proteins Rho durch Exoenzym C3 hat keinen
Einfluß auf die Ca2+ Sensitivierung durch ATPyS 69
5.3 Hohe Konzentrationen (2 nM) Staurosporin hemmen die Ca2+
Sensitivierung durch ATPyS 71
5.4 Einfluß von Y 27632 und Staurosporin auf die MLC20
Phosphorylierung bei der ATPyS induzierten Ca2+
Sensitivierung 72
5.5 Wirkung weiterer Proteinkinasen Inhibitoren auf die ATP7S
induzierte Ca2+ Sensitivierung 73
5.6 Nachweis der Thiophosphorylierung der regulatorischen
Untereinheit der Myosin leichte Ketten Phosphatase (MYPT1)
durch radioaktiv markiertes [3SS] yATP 73
5.7 ATPyS induzierte Ca2+ Sensitivierung in Triton X 100
permeabilisierten Präparaten 76
5.8 Konkurrenz von ATPyS mit ATP führt zu unterschiedlich
starker Ca2+ Sensitivierung durch Thiophosphorylierung^ 77
5.9 Kinetische Parameter zur Thiophosphorylierung der
regulatorischen Untereinheit der MLCP (MYPT1) durch
ATPyS 78
5.10 Western Blot Analyse von Proteinen in Triton X 100 und ß
Escin permeabilisierter glatter Muskulatur des Ileums 80
5.11 Wirkung von GTPyS auf die ATPyS induzierte Ca2+
Sensitivierung 81
V Diskussion .84
1. Charakterisierung des experimentellen Systems 84
2. Die Rolle des kleinen G Proteins Ras bei der Kontraktion des
glatten Muskels .86
IV Inhaltsverzeichnis
3. Der Beitrag des Rho/Rho Kinase Signalweges an der Agonisten
induzierten Ca2+ Sensitivierung_ .89
4. Ca2+ Sensitivierung durch Thiophosphorylierung bei
Ileumpräparaten wird nicht von der Rho Kinase
hervorgerufen .90
5. Additive Ca^ Sensitivierung durch GTPyS zusätzlich zur
ATPyS induziertenCa^ Sensitivierung. .95
6. Signalkaskaden, die für die ATPyS induzierte Ca2+
Sensitivierung der Kontraktion verantwortlich sind .96
VI Zusammenfassung .98
VllSummary .99
VIII Literaturverzeichnis 100
IX Danksagung 110
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