Charakterisierung der Substratspezifität coronaviraler 3C-like-Proteasen:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
V
INHALTSVERZEICHNIS
SUMMARY 1
ZUSAMMENFASSUNG 3
1 EINLEITUNG 5
1.1 ENA-VIREN UND IHRE REPLIKATIONSSTRATEGIEN. 5
1.2 VIRALE POLYPROTEINPROZESSIERUNG. 6
1.3 VIRALE PROTEINASEN . 7
1.3.1 PROTEASEN UND IHRE EINTEILUNG IN MECHANISTISCHE GRUPPEN. 7
1.3.2 VERTRETER VIRALER PROTEINASEN. 9
1.4 PROTEINASEINHIBITOREN UND HTS-ASSAYS. 11
1.5 CORONAVIREN. 11
1.5.1 ALLGEMEINES. 11
1.5.2 PATHOLOGIE. 13
1.5.3 GENOMORGANISATION UND REPLIKATION DER CORONAVIREN. 13
1.5.4 DIE SUBGENOMISCHEN MRNAS DER CORONAVIREN. 14
1.5.5 DAS CORONAVIRALE REPLIKASEGEN. 15
1.5.6 DIE CORONAVIRALEN AKZESSORISCHEN PROTEINASEN (PLPRO). 17
1.5.7 DIE CORONAVIRALE HAUPTPROTEINASE (3CLPRO). 21
2 ZIELSTELLUNG 27
3 MATERIALIEN UND LOESUNGEN 28
3.1 PUFFER UND LOESUNGEN. 28
3.2 BESONDERE CHEMIKALIEN. 30
3.3 ENZYME UND ANDERE PROTEINE. 31
3.4 PLASMIDE UND VERWENDETE KONSTRUKTE. 32
3.5 DNA-LAENGENSTANDARDS. 32
3.6 NUKLEOTIDE. 32
3.7 OLIGONUKLEOTIDE. 33
3.8 PEPTIDE . 34
3.8.1 SYNTHETISCHE PEPTIDE. 34
3.8.2 SYNTHETISCHES FLUOROGENES PEPTID. 34
3.8.3 SONSTIGE SYNTHETISCHE PEPTIDE. 34
3.9 ZELLKULTUR. 35
3.9.1 MEDIEN UND MEDIENZUSAETZE. 35
3.9.2 ZELLLINIEN. 35
3.10 VIRUSSTAEMME . 35
3.11 BAKTERIENSTAEMME. 35
3.12 MEDIEN, MEDIENZUSAETZE UND PLATTEN FUER BAKTERIENKULTUREN. 35
3.13 GERAETE. 36
3.14 VERSCHIEDENES. 37
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
VI
4 METHODEN 38
4.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN. 38
4.1.1 ZELLKULTUR. 38
4.1.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN. 38
4.2 VIROLOGISCHE METHODEN. 38
4.2.1 INFEKTION VON MONOLAYER-ZELLKULTUREN MIT FIPV UND TGEV . 38
4.3 SELEKTION VON POLY(A+)-RNA MIT DYNABEADS DT
2
O YY 38
4.4 GELELEKTROPHORESESYSTEME . 39
4.4.1 TBE-AGAROSEGELE. 39
4.4.2 TAE-AGAROSEGELE. 39
4.4.3 SDS-HALTIGE AGAROSEGELE. 39
4.4.4 SDS-POLYACRYLAMIDGELE. 40
4.5 ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN. 40
4.5.1 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON PLASMID-DNA. 40
4.5.2 REINIGUNG VON DNA.*.7. 41
4.5.3 PRAEZIPITATION VON NUKLEINSAEUREN. 41
4.5.4 MODIFIZIERUNG VON DNA-ENDEN. 42
4.5.5 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN. 42
4.5.6 SPEKTROPHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREMENGE . 42
4.5.7 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) . 43
4.5.8 RT-PCR (CDNA-SYNTHESE UND AMPLIFIKATION). 43
4.5.9 AUTOMATISIERTE DNA-SEQUENZIERUNG (ABI PRISM
YY
-SYSTEM 310) 44
4.6 ARBEITEN MIT BAKTERIEN. 44
4.6.1 BAKTERIENKULTUR. 44
4.6.2 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN. 44
4.6.3 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM ANALYTISCHEN MASSSTAB. 45
4.6.4 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB. 45
4.7 PROTEINCHEMISCHE METHODEN . 46
4.7.1 EXPRESSION UND REINIGUNG VON MBP-FUSIONSPROTEINEN. 46
4.7.2 AUFREINIGUNG VON FAKTOR-XA-GESPALTENEN FUSIONSPROTEINEN MITTELS
FPLC. 47
4.7.3 DIALYSE. 48
4.7.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN.Y. 48
4.7.5 KONZENTRIERUNG VON PROTEINEN.
*
. 48
4.7.6 PEPTIDSYNTHESE. 48
4.8 FUNKTIONELLE ENZYMATISCHE ASSAYS. 49
4.8.1 EINFACHER PEPTIDSPALTUNGSASSAY. 49
4.8.2 KOMPETITIVER PEPTIDSPALTUNGSASSAY ZUR (UMAX/KM)REI-BESTIMMUNG 49
4.8.3 KONTINUIERLICHER FLUOROGENER ASSAY. 49
4.8.4 INHIBITORSTUDIEN MIT HILFE DES KONTINUIERLICHEN FLUOROGENEN ASSAYS
50
4.9 ANALYSEMETHODEN ENZYMATISCHER ASSAYS . 50
4.9.1 REVERSED-PHASE-HPLC (RP-HPLC). 50
4.9.2 FLUOROSKAN II. 50
INHALTSVERZEICHNIS VII
5 ERGEBNISSE 52
5.1 KLONIERUNG, EXPRESSION UND AUFREINIGUNG CORONAVIRALER
3C-LIKE-PROTEIN-
ASEN FUER DIE BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG. 52
5.1.1 KLONIERUNG, SEQUENZANALYSE UND EXPRESSION DER FIPV-3CLPRO . . 52
5.1.2 KLONIERUNG UND EXPRESSION DER TGEV-3CLPRO. 59
5.1.3 KLONIERUNG UND EXPRESSION DER IBV-3CLPRO . 60
5.1.4 PARTIELLE AUFREINIGUNG CORONAVIRALER 3C-LIKE-PROTEINASEN. 61
5.1.5 WEITERE AUFREINIGUNG DER MBP-3CLPR-FUSIONSPROTEINE. 63
5.2 NACHWEIS DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET DER PARTIELL GEREINIGTEN
3C-LIKE-PRO-
TEINASEN. 67
5.2.1 NACHWEIS DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET DER FIPV-3CL
PRO IN EINEM
SPEZIFISCHEN TRANS-SPALTUNGSASSAY. 67
5.2.2 NACHWEIS DER BIOLOG. AKTIVITAET DER ANDEREN 3C-LIKE-PROTEINASEN . .
69
5.3 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG CORONAVIRALER 3C-LIKE-PROTEINASEN
. 71
5.3.1 BESTIMMUNG DES (RW/-FCN)RER WERTES- MITTELS KOMPETITIVEN PEP-
TIDSPALTUNGSASSAYS . 71
5.3.2 KONSERVIERUNG DER 3CLPRO-SUBSTRATSPEZIFITAET ZWISCHEN REPRAESENTA
TIVEN VIREN VERSCHIEDENER CORONAVIRUSGRUPPEN. 80
5.3.3 HTS-ASSAY FUER DIE SUCHE NACH POTENTIELLEN INHIBITOREN DER CORO
NAVIRALEN 3CL
PRO . 82
5.3.4 INHIBIERUNG DER 3C-LIKE-PROTEINASE-AKTIVITAET UNTER VERWENDUNG DES
KONTINUIERLICHEN FLUOROGENEN ASSAYS. 87
5.4 AUFREINIGUNG DER 3C-LIKE-PROTEINASE VON FIPV UND TGEV ZU
KRISTALLISA
TIONSZWECKEN . 89
5.4.1 AUFREINIGUNG DER FIPV-3C-LIKE-PROTEINASE BIS ZUR HOMOGENITAET . 89
5.4.2 AUFREINIGUNG DER TGEV-3C-LIKE-PROTEINASE BIS ZUR HOMOGENITAET . 98
6 DISKUSSION ,
104
6.1 SYNTHESE UND AUFREINIGUNG CORONAVIRALER 3C-LIKE-PROTEINASEN.105
6.1.1 SEQUENZANALYSE DER FIPV-3CLPRO.105
6.1.2 BAKTERIELLE EXPRESSION UND PARTIELLE AUFREINIGUNG BIOLOGISCH AKTI
VER CORONAVIRALER 3C-LIKE-PROTEINASEN.106
6.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG CORONAVIRALER 3C-LIKE-PROTEINASEN
. 108
6.2.1 UNTERSUCHUNG DER SUBSTRATSPEZIFITAET CORONAVIRALER 3C-LIKE-PROTE-
INASEN MIT HILFE KOMPETITIVER SPALTUNGSASSAYS.108
6.2.2 HTS-ASSAY FUER DIE SUCHE NACH POTENTIELLEN INHIBITOREN DER CORO
NAVIRALEN 3CLPRO .111
6.3 AUFREINIGUNG DER FIPV- UND TGEV-3CLPRO ZU KRISTALLISATIONSZWECKEN .
. 115
6.4 FOLGERUNG.117
A ABKUERZUNGEN UND EINHEITEN 118
A.L ABKUERZUNGEN.118
A.2 EINHEITEN .121
INHALTSVERZEICHNIS VIUE
LITERATUR 122
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 137
TABELLENVERZEICHNIS 139
VEROEFFENTLICHUNGEN 140
LEBENSLAUF
141 |
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