Intrazelluläres Trafficking von Liposomen:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Freiburg (Breisgau), Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | VII, 161 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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A
INTRAZELLULAERES TRAFFICKING VON LIPOSOMEN
INAUGURAL-DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE
DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND PHARMAZIE
DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITAET
ZU FREIBURG I. BR.
VORGELEGT VON:
ANSGAR WIESCHOLLEK
AUS AACHEN
FREIBURG 2002
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABKUERZUNGEN VI
1 EINLEITUNG 1
1.1 LIPOSOM-ZEU-WECHSELWIRKUNGEN 3
1.1.1 INTERMEMBRANTRANSFER 3
1.1.2 FREISETZUNG NACH KONTAKT 3
1.1.3 ADSORPTION 4
1.1.4 FUSION 5
1.2 ENDOZYTOSE 6
1.2.1 PHAGOZYTOSE 7
1.2.2 CLATHRIN-ABHAENGIGE ENDOZYTOSE 8
1.2.3 CLATHRIN-UNABHAENGIGE ENDOZYTOSE 9
1.2.3.1 CAVEOLEN .* 9
1.2.3.2 MAKROPINOZYTOSE 10
1.2.3.3 STEMS 11
1.3 INTRAZELLULAERES TRAFFICKING DURCH ENDOZYTOTISCHE ORGANELLEN 12
1.3.1 ENDOSOME 13
1.3.1.1 FRUEHE ENDOSOME 14
1.3.1.2 SPAETE ENDOSOME 15
1.3.2 LYSOSOME 15
1.3.3 TRANSPORT VON FRUEHEN ZU SPAETEN ENDOSOMEN 16
1.3.4 TRANSPORT VON SPAETEN ENDOSOMEN ZU LYSOSOMEN 16
1.4 PH-SENSITIVE LIPOSOMEN 18
1.4.1 LIPOSOMENHERSTELLUNG: 18
1.4.2 GOESSENBESTINUNUNG MITTELS
LASER-PHOTONEN-AUTOKORRELATIONS-SPEKTROSKOPIE (PCS) 19
1.4.3 PH-SENSITIVE LIPIDE 20
1.4.4 MECHANISMUS DER PH INDUZIERTEN DESTABILISIERUNG 21
1.5 NACHWEISMETHODEN DES INTRAZELLULAEREN TRAFFICKINGS 23
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
1.5.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 23
1.5.1.1 LANG-UND KURZPASSFILTER 24
1.5.1.2 BANDPASSFILTER 24
1.5.1.3 FARBTEILER 25
1.5.2 KONFOKALE LASER-SCANNNING MIKROSKOPIE 26
1.5.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 27
1.5.4 SPECTRAL-IMAGING 28
1.5.4.1 AUFBAU 28
1.5.4.2 PRINZIP DER FOURIER-SPEKTROSKOPIE 30
1.5.4.3 INTERFEROMETER 31
1.5.4.4 CCD KAMERA 31
1.5.4.5 FILTERSETS 32
1.6 SPEZIELLE ANWENDUNGEN DES SPECTRAL-IMAGING 35
1.6.1 GRANULOZYTEN 35
1.6.1.1 ENTSTEHUNG, EINTEILUNG UND FUNKTION DES GRANULOZYTEN 36
1.6.1.2 SEPTISCHE GRANULOMATOSE 36
1.6.2 MITOCHONDRIEN 37
1.6.2.1 AUFBAU & FUNKTION 38
1.6.2.2 MITOCHONDRIALES GENOM 39
1.6.2.3 MITOCHONDRIALE ERKRANKUNGEN 39
1.6.2.4 MITOCHONDRIALE GENTHERAPIE 40
1.6.2.5 DEQUALINIUM 41
1.7 ZIEBETZUNG DER ARBEIT 43
2 MATERIALIEN 44
2.1 LIPIDE 44
2.2 FLUORESZENZFARBSTOFFE 44
2.3 ZELLKULTURREAGENZIEN 45
2.4 CHEMIKALIEN UND LOESUNGSMITTEL 46
2.5 VERBRAUCHSMATERIALIEN 47
2.6 GERAETE 48
2.7 SPECTRACUBE* SYSTEM 50
2.8 PUFFER 50
2.9 ZELLEN 52
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3 METHODEN 53
3.1 LIPOSOMENHERSTELLUNG DURCH EXTRUSION 53
3.2 LIPOSOMENCHARAKTERISIERUNG 54
3.2.1 GROESSENBESTIMMUNG MITTELS PCS 54
3.2.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER PHOSPHOLIPIDE MIT DER METHODE NACH
BARTLETT 55
3.2.3 GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE(GPC) 56
3.2.4 BESTIMMUNG DER VERKAPSELUNGSEFFIZIENZ 57
3.3 ZELLEN 59
3.3.1 ZELLLINIEN 59
3.3.2 PRIMAERZELLEN 60
3.3.2.1 ISOLIERUNG VON GRANULOZYTEN AUS HUMANEM VOLLBLUT 60
3.3.2.2 VORBEREITUNG FUER MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 61
3.4 NACHWEISMETHODEN DES INTRAZELLULAEREN TRAFFICKINGS UND AUFARBEITUNG
DER ZELLLINIEN 62
3.4.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 62
3.4.2 KONFOKALE MIKROSKOPIE 63
3.4.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 63
3.4.4 SPEKTRALE BILDANALYSE 64
3.4.4.1 VORBEREITUNG DER ZELLEN FUER DAS SPECTRAL-IMAGING 65
3.4.4.2 ZELLANFAERBUNG MIT ZELLMARKERN 65
4 ERGEBNISSE & DISKUSSION 66
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER FLUORESZENZFARBSTOFFE 66
4.1.1 LIPOSOMALE FLUORESZENZFARBSTOFFE 67
4.1.1.1 FITC-DEXTRAN, FITC-ODN 67
4.1.1.2 PYRANIN 67
4(1.1.3 RHODAMIN-B-PE 68
4.1.2 ZELLMARKER 69
4.1.2.1 LYSOTRACKER* RED 69
4.1.2.2 MITOTRACKER* RED 70
4.1.2.3 DAPI 71
4.1.2.4 VYBRANT*DIO 72
4.2 PH-SENSITIVE LIPOSOMEN 73
4.2.1 ZELLVERSUCHE MIT VERKAPSELTEM PYRANIN 73
III
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.1.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 74
4.2.1.2 KONFOKALE MIKROSKOPIE 76
4.2.1.3 ZUSAMMENFASSUNG 78
4.2.2 ZELLVERSUCHE MIT LIPOSOMALEM FITC-DEXTRAN 78
4.2.2.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 79
4.2.2.2 KONFOKALE MIKROSKOPIE 81
4.2.2.3 ZUSAMMENFASSUNG: 83
4.2.3 STABILITAETSUNTERSUCHUNGEN 85
4.2.3.1 VERGLEICH DER INKUBATIONSMEDIEN 86
4.2.3.2 INKUBATION MIT STEIGENDER CALCIUM-KONZENTRATION 87
4.2.3.3 ZUSAMMENFASSUNG 89
4.2.4 FREISETZUNGSSTUDIEN 91
4.2.4.1 PH-ABHAENGIGKEIT VON PYRANIN 91
4.2.4.2 CHARAKTERISIERUNG VON DPX 92
4.2.4.3 LIPOSOMEN 92
4.2.4.4 VERSUCHSDESIGN 93
4.2.4.5 FREISETZUNGSVERSUCHE AUS PH-SENSITIVEN LIPOSOMEN 94
4.2.4.6 FREISETZUNG AUS EPC-LIPOSOMEN 97
4.2.4.7 BESTIMMUNG DER PERMEATIONSKOEFFIZIENTEN 99
4.2.4.8 ZUSAMMENFASSUNG 104
4.3 SPECTRAL-ITNAGITTG 105
4.3.1 VERSUCHSBEDINGUNGEN 105
4.3.1.1 LIPOSOMENHERSTELLUNG 105
4.3.1.2 INKUBATION DER ZELLEN MIT LIPOSOMEN 106
4.3.1.3 ZELLMARKER 106
4.3.2 ZELLVERSUCHE 106
4.3.2.1 EINZELFAERBUNGEN 106
4.3.2.2 DOPPELFAERBUNG 110
4.3.2.3 DREIFACHFAERBUNG 111
4.3.2.4 FUENFFACHFAERBUNGEN 113
4.3.3 DISKUSSION DER ERGEBNISSE 115
4.3.3.1 LONGPASSFILTER 115
4.3.3.2 TRIPLEBANDPASSFILTER 116
4.3.3.3 VERLAUF DER ERHALTENEN EMISSIONSSPEKTREN UND AUSWIRKUNGEN AUF
DIE BILDANALYSE 117 4.3.3.4 SPECTRACUBE* 118
4.3.4 ZUSAMMENFASSUNG 119
4.4 GRANULOZYTEN 120
4.4.1 INKUBATION MIT PH-SENSITIVEN LIPOSOMEN 120
4.4.1.1 EINZELFAERBUNGEN 120
4.4.1.2 DOPPELFAERBUNG 124
4.4.1.3 VIERFACHFAERBUNG 125
RV
IMAGE 6
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.1.4 ZUSAMMENFASSUNG: 126
4.4.2 INKUBATION MIT NICHT PH-SENSITIVEN LIPOSOMEN 128
4.4.2.1 EINZELFAERBUNGEN 128
4.4.2.2 DOPPELFAERBUNGEN 130
4.4.2.3 VIERFACHFAERBUNG 132
4.4.2.4 ZUSAMMENFASSUNG 133
4.5 MITOCHONDRIEN 135
4.5.1.1 AUFNAHME DER REFERENZSPEKTREN 135
4.5.1.2 DQA & MITOTRACKER: 138
4.5.1.3 KONDENSIERUNG DER FITC-ODN MIT DQA 139
4.5.1.4 FITC-ODN, DQA UND MITOTRACKER* IN EINER DREIFACHANFAERBUNG 144
4.5.2 ZUSAMMENFASSUNG 145
5 ZUSAMMENFASSUNG 146
6 LITERATUR 149
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