Molekulare Analyse einer subtraktiven cDNA-Bank aus aktivierten Makrophagen:
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2001
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| adam_text | Titel: Molekulare Analyse einer subtraktiven cDNA-Bank aus aktivierten Makrophagen
Autor: Schoemperlen, Christina
Jahr: 2001
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abkilrzungsverzeichnis und Glossar
1 Einleitung 1
2 Literaturubersicht 2
2.1 Makrophagen 2
2.1.1 Bedeutung undVorkommen 2
2.1.2 Morphologie 3
2.1.3 Monozytopoiesis, Differenzierung und Heterogenitdt 3
2.1.4 Funktion ... 4
2.1.5 Aktivierung 6
2.1.6 Differenzierung und Aktivierung von myeloiden Leukdmiezellen 1
2.2 Interferon y 8
2.2.1 Interferone 8
2.2.2 Der IFNy-Signaltransduktionsweg 9
2.2.3 Immunregulatorische Funktionen von IFNy 11
2.2.3.1 Antigenprdsentation 12
2.2.3.2 Antimikrobielle Effekte 12
2.2.3.3 Antivirale Effekte 13
2.2.3.4 Wirkung auf Proliferation und Apoptosis von Zellen 14
2.2.3.5 Wirkung auf Lymphozyten 14
2.2.3.6 Interaktion von Leukozyten undEndothelzellen 15
2.3 Tryptophan-Metabolismus 16
2.3.1 Tryptophan 2,3-Dioxygenase (TDO) 16
2.3.2 Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) 17
2.4 Strategien zur Isolierung IFNy-induzierbarer cDNA-Sequenzen 18
20
20
21
21
22
22
23
24
...... 24
27
Materialien
3.1 Chemikalien
3.2 Enzyme, Proteine und Reaktionssysteme
3.3 Antikorper
3.4 Zellkulturmaterialien
3.5 Verbrauchsmaterialien
3.6 GerSte
3.7 Software fur EDV
3.8 Puffer, Losungen und Nahrraedien
3.9 Eukaryontische Zellinien
Inhaltsverzeichnis
3.10 Bakterienstamme 28
3.11 Vektoren und cDNA-Genbanken 29
3.12 Gelelektrophorese-Langenstandards 30
3.13 Primer 31
Methoden 32
4.1 Techniken zum Arbeiten mit DNA RNA 32
4.1.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 32
4.1.2 Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsduren 33
4.1.3 Aufreinigungvon PCR-Fragmenten 34
4.1.4 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 34
4.1.5 Phenol-Extraktion von Nukleinsauren 34
4.1.6 Ethanol-Fallung von Nukleinsauren 35
4.1.7 Verdau von DNA durch Restriktionsendonukleasen 35
4.1.8 Ligation von DNA-Fragmenten 35
4.1.9 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsauren 36
4.1.10 In vitro Transkription rekombinanter cDNA 36
4.1.11 Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryonten Zellen 37
4.1.12 DNA-Sequenzierung 38
4.1.13 KapillartransfervonRNAaufNylonmembran 39
4.1.14 Northern-Hybridisierung mit Digoxigenin (DIG)-markierten Sonden 40
4.2 Techniken zum Arbeiten mit Zellkulturen und Blutzellen 42
4.2.1 Zellkultiviervng 42
4.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellinien 42
4.2.3 Bestimmung der Zellzahl in der Neubauer-Zdhlkammer 42
4.2.4 Induktion von Zellen 42
4.2.5 Prdparation vonperipheren Blutzellpopulationen 44
4.3 Techniken zum Arbeiten mit Phagen und Bakterien 46
4.3.1 Elektrotransformation von Bakterien 46
4.3.2 InvivoExzision 47
4.3.3 Miniprdparation von Plasmid-DNA 48
4.3.4 Midiprdparation von Plasmid-DNA 48
4.4 Techniken zum Arbeiten mit Proteinen 49
4.4.1 Polyacrylamid-SDS-Gelelektrophorese (SDS-Page) 49
4.4.2 Radioaktive in vitro Translation 50
4.4.3 Immunoblot (Western Blot) zur Antikorper-Uberprufung 51
4.4.4 Expression und Aufreinigung des MBP-904-Fusionsproteins 51
4.4.5 Expression des GBP-904-Fusionsproteins 53
Lnhaltsverzeichnis
5 Ergebnisse 55
5.1 Isolierung induzierter cDNAs 56
5.1.1 Subtrahierte cDNA-Bank aus aktivierten Makrophagen 56
5.1.2 PCR undSequenzanatyse 56
5.1.3 Computeranalysen 58
5.1.4 Analyse der cDNA-Klone 79
5.1.4.1 Bekannte cDNAs 79
5.1.4.2 Unbekannte cDNAs 96
5.2 Untersuchungen der mRNA-Expression 102
5.2.1 Tryptophan-2,3-Dioxygenase 102
5.2.2 Syntaxin 10 106
5.2.3 Inositol-Phosphat 5-Phosphatase 107
5.2.4 GEM-GTPase 108
5.2.4 Klon 2687 (Coronin-Homolog) 109
5.3 Analyse des cDNA-Klons 904-5 113
5.3.1 Analyse aufDNA-Ebene 113
5.3.2 Analyse aufRNA-Ebene 115
5.3.3 Analyse aufAminosdure-Ebene 120
5.3.3.1 In vitro Transkription und Translation des Klones 904-5 122
5.3.3.2 Herstellung eines 904-5-Fusionsproteins 123
6 Diskussion 126
6.3 Tryptophan-2,3-Dioxygenase 129
6.2 Syntaxin 10 130
6.3 Inositol-Phosphat 5-Phosphatase 131
6.4 GEM-GTPase 133
6.5 cDNA-Klon 2687 133
6.6 cDNA-Klon 904-5 135
7 Zusammenfassung/Summary 137
8 Literaturverzeichnis 140
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb .2-1: Die zentrale Bedeutung von Makrophagen in der Immunabwehr 5
Abb.2-2: Model der IFNy-induzierten Signaltransduktion 10
Abb.2-3: Ubersicht des Tryptophan-Metabolismus 16
Abb.5-1: Obersicht der Ergebnisse 54
Abb.5-2: PCR-Produkte isolierter cDNA-Klone 57
Abb.5-3: Expression der Tryptophan 2,3 Dioxygenase-mRNA in induzierten
humanen Zellinien 103
Abb,5-4: Expression der Tryptophan 2,3 Dioxygenase-mRNA in TPA- und
Bt2cAMP-induziertenU937undTHP-l-Zellen 104
Abb.5-5: Expression der Tryptophan 2,3 Dioxygenase-mRNA in humanem
Gewebe .......................... 105
Abb.5-5: Expression der Syntaxin 10-mRNA in U937 und THP-1-Zellen 106
Abb.5-6: Expression der Inositol-Phosphat 5-Phosphatase-mRNA in U937 und
THP-1-Zellen 107
Abb.5-7: Expression der GEM-mRNA in THP-1-Zellen 108
Abb.5-9a: Vergleich der Aminosauresequenz des Coronin-ahnlichen Proteins der
Ratte mit dem ORF+3 des cDNA-Klons 2687 110
Abb.5-9b: Vergleich der Aminosauresequenz des Coronin-Shnlichen Proteins des
Rindes mit dem ORF+3 des cDNA-Klons 2687 110
Abb.5-9c: Vergleich der Aminosauresequenz des Coronin-ahnlichen Proteins des
Menschen p57 mit dem ORF+3 des cDNA-Klons 2687 111
Abb.5-9d: Vergleich der Aminosauresequenz des Coronins von Dictyostelium
discoideum mit dem ORF+3 des cDNA-Klons 2687 111
Abb.5-10: Expression von Klon 2687-mRNA in unterschiedlich induzierten
humanen Zellinien 112
Abb.5-11: Sequenzierprimer des cDNA-Klones 904-5 113
Abb. 5-12: Nukleinsauresequenz von Klon 904-5 114
Abb.5-13: Expression der mRNA des cDNA-Klones 904-5 in verschiedenen
humanen Zellinien nach Induktion 115
Abb.5-14a: Regulation der mRNA-Expression des Klones 904-5 in Zellinien
hamatopoetischen und nicht hamatopoetischen Ursprungs nach TPA-
Induktion 116
Abb.5-14b: Regulation der mRNA-Expression des Klones 904-5 in Zellinien
hamatopoetischen und nicht hamatopoetischen Ursprungs nach IFNy-
Induktion 117
Abb.5-15: Regulation der 904-5 mRNA-Expressiondurch TPA und Bt2cAMP in
U937- und THP-1-Zellen 118
Abb.5-16: Expression der mRNA des Klones 904-5 in humanem Gewebe 119
Abb.5-17: Aminosauresequenz des Klones 904-5 121
Abbildungsverzeichnis und Tabellenverzeichnis
Abb.5-18: Agarose-Gelelektrophorese des in vitro-Transkriptes des cDNA-Klones
904-5 122
Abb.5-19: Autoradiographie des in vitro-Tranlates des cDNA-Klones 904-5 123
Abb.5-20a: Expression des 904-5-MBP-Fusionsproteins 125
Abb.5-20b: Expression des 904-5-GST-Fusionsproteins 125
Abb.6-1: Inositol Phospholipid Metabolismus 132
Tabellenverzeichnis
Tab.2-1: Vorkommen von mononuklearen Zellen im Korper 2
Tab.2-2: Vergleich von IDO und TOO 17
Tab.4-1: Zusammensetzung der SDS-PAGE-Matrix fur unterschiedliche
Trennbereiche 49
Tab.5-1: cDNA-Sondenpool aus IFNy-induzierten Genen 55
Tab.5-2: Gesamtubersicht der isolierten cDNA-Klone 58
Tab.5-3: Analyse der isolierten cDNA-Klone 59
Tab.5-4: Ubersicht der isolierten cDNAs I 79
Tab.5-5: Ubersicht der isolierten cDNAs II 81
Tab.5-6: Beschreibung ausgewahlter cDNAs 83
Tab.5-7a: Ubersicht der isolierten cDNAs HI 96
Tab.5-7b: Isolierte cDNA-Klone ohne Homologie zu bekannten Sequenzen 96
Tab.5-7c: Isolierte cDNA Klone, deren Sequenz durch Sequenzierprojekte oder
EST bekannt ist 98
Tab.5-7d: Kurzbeschreibung und Analyse der cDNA Klone mit signifikanter
Homologie zu bekannten Genen 101
Tab.5-8: Aminosauren und ihre Symbole 109
Tab.5-9: Ubersicht der mRNA-Expression des cDNA-Klones 904-5 in humanen
Zellinien 118
Tab.5-10: Ubersicht der mRNA-Expression des cDNA-Klones 904-5 in humanen
peripheren Blutzellen 120
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