Untersuchungen zur Signaltransduktion und biologischen Funktion des Stammzellfaktorrezeptors in Zellen einer akuten myeloischen Leukämie: Untersuchungen an CHRF-Zellen
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INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
1. SIGNALWEGE UND IHRE REGULATION 1
2. INTERAKTIONEN DES STAMMZELLFAKTORREZEPTORS MIT DER PI-3-KINASE SOWIE
MIT 8
PTP IC UND ID
3. BIOLOGISCHE BEDEUTUNG DES STAMMZELLFAKTORREZEPTORS UND SEINES
LIGANDEN 9
4. HERKUNFT UND EIGENSCHAFTEN DER CHRF-ZELLEN 11
II. AUFGABENSTELLUNG 13
III. MATERIALIEN UND METHODEN 15
A. MATERIALIEN 15
B. METHODEN 18
1. ZELLKULTUR 18
1.1. STANDARDKULTIVIERUNG DER CHRF-ZELLEN 18
1.2. VORINKUBATION UND STIMULATION 18
1.3. KULTURBEDINGUNGEN ZUR UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON
STAMMZELLFAKTOR 19
UND ZYTARABIN
2. PROTEINBIOCHEMIE 20
2.1. PROTEINBESTIMMUNG , 20
2.2. ZELLLYSE 20
2.3. IMMUNPRAEZIPITATION 21
2.4. SDS-PAGE 23
2.5. WESTERN BLOT 24
2.6. PI-3-KINASE-AKTIVITAETSBESTIMMUNG 25
2.7. DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 26
2.8. ZYTOSOLPRAEPARATION NACH RITTENHOUSE 27
2.9. PHOSPHOPROTEINPHOSPHATASE-AKTIVITAETSBESTIMMUNG 28
3. MOLEKULARBIOLOGIE 30
3.1. RNA-ISOLIERUNG 31
3.2. SYNTHESE DER CDNA 31
3.3. PCR UND DNA-ELEKTROPHORESE 32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.4. KLONIERUNG DER PCR-PRODUKTE IN E. COLI 34
3.5. SEQUENZIERUNG NACH SAENGER 38
3.6. RNA-GEL UND NORTHERN-BLOT 40
4. DURCHFLUSSZYTOMETRIE 42
4.1. ZELLZYKLUSANALYSE 43
4.2. OBERFLAECHENANALYSE (CD 117, CD 34, ANNEXIN) 43
IV. ERGEBNISSE 45
1. INTERAKTIONEN ZWISCHEN KIT UND DEN ZU UNTERSUCHENDEN SIGNALMOLEKUELEN
45
IN ABHAENGIGKEIT VON SCF UND NACHWEIS DER KIT-ASSOZIIERTEN
PHOSPHATIDYLINOSITOL-3-KINASE- AKTIVITAET
2. EINFLUSS VON WORTMANNIN AUF DIE REZEPTORPHOSPHORYLIERUNG SOWIE DIE 49
INTERAKTIONEN ZWISCHEN KIT UND PTP'S BZW. PI-3-KINASE ~
3. EINFLUSS VERSCHIEDENER PROTEINKINASEINHIBITOREN AUF DIE ASSOZIATION 51
ZWISCHEN KIT UND PTP IC
4. EINFLUSS DER PROTEINKINASEINHIBITOREN AUF DIE PI-3-KINASEAKTIVITAET 52
5. EINFLUSS VON CGP 53716 AUF DIE ASSOZIATION KIT/ P85 SOWIE DIE 55
REZEPTORASSOZIIERTE PI-3-KINASE-AKTIVITAET IN ABHAENGIGKEIT VON SCF
6. MESSUNG DER PHOSPHATASEAKTIVITAET NACH IMMUNPRAEZIPITATION VON KIT 58
UND PTP IC
7. UNTERSUCHUNGEN AM PDGF-REZEPTOR 60
8. EXPERIMENTE ZUR ZELLULAREN LOKALISATION DER UNTERSUCHTEN
SIGNALMOLEKUELE 61
(GESAMTLYSAT VS.ZYTOSOL)
9. PHOSPHORYLIERUNGSZUSTAND PI-3-KINASE-ASSOZIIERTER PROTEINE IN
ABHAENGIGKEIT 62
VON SCF UND CGP 53716
10. KLONIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN AUS KIT UND SCF / 64
11. DNA-SEQUENZEN DER PCR-PRODUKTE 65
12. NACHWEIS DER KIT-MRNA IM NORTHERN BLOT 66
13. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE CHARAKTERISIERUNG DER CHRF-ZELLEN 67
14. PROLIFERATION UND KIT-EXPRESSION DER CHRF-ZELLEN IN ABHAENGIGKEIT 70
VON SCF, ZYTARABIN UND SERUM
V. DISKUSSION
72
80
83
ABBILDUNGVERZEICHNIS
DANKSAGUNG
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG
VI. ZUSAMMENFASSUNG
VII. LITERATURVERZEICHNIS
LEBENSLAUF |
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