Biochemische Untersuchungen zur Rolle des Tumorsuppressorproteins P53 bei der Replikation und Reparatur der DNA:
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1
I. INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.1
1.1. DAS TUMORSUPPRESSORPROTEIN P53.1
1.1.1. ENTDECKUNG VON TP53.2
1.1.2. STRUKTUR VON TP53. 2
1.1.3. DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR TP53.3
1.1.4. DIE ROLLE VON TP53 IN DER APOPTOSE.5
1.1.5. TP53-PROTEIN INTERAKTIONEN.5
1.1.6. DIE TP53-ASSOZIIERTE EXONUKLEASEAKTIV ITAET.6
1.2. MECHANISMUS UND GENAUIGKEIT DER DNA-REPLIKATION.7
1.3. ARBEITSHYPETHESE. 11
2. MATERIALIEN.12
2.1. ANTIKOERPER.12
2.2. OLIGONUKLEOTIDE.13
2.3. PLASMIDE.13
2.4. BACULOVIREN.14
2.5. BAKTERIENSTAEMME. 14
2.6. ZELLINIEN.14
2.7. ZELLKULTURMEDIEN.I.15
3. METHODEN.15
3.1. ZELLANZUCHT.15
3.1.1. AUFTAUEN DER ZELLEN. 15
3.1.2. KULTIVIERUNG.15
3.2. EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE.16
3.2.1. EXPRESSION IN INSEKTENZELLEN.16
3.2.2. EXPRESSION IN
ESCHERICHIA COLI BL21 DE3.16
3.3. HERSTELLUNG MONOKLONALER IMMUNAFFINITAETSSAEULEN.17
3.3.1. REINIGUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER.17
3.3.2. IMMOBILISIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER.17
3.4. IMMUNAFFINITAETSREINIGUNG VON BOVINER POL A-PRIM AUS KALBSTHYMUS.18
3.5. IMMUNAFFINITAETSREINIGUNG VON POL
A-
PRIM UND TP53 AUS HSC 93 ZEUEN.19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/963788434
INHALTSVERZEICHNIS _II
3.6. IMMUNAFFINITAETSREINIGUNG REKOMBINANTER POL CT-PRIM AUS
INSEKTENZELLEN.20
3.7. KONVENTIONELLE REINIGUNG REKOMBINANTER POL A-PRIM UND TP53.22
3.8. REINIGUNG VON REKOMBINANTEM HIS-TAG TP53.23
3.9. REINIGUNG VON REKOMBINANTEM GST-TP53 AUS
E. COLI.23
3.10. IMMUNPRAEZIPITATION.24
3.11. ANALYSE VON PROTEINEN. 25
3.11.1. SEDIMENTATION VON PROTEINEN DURCH ULTRAZENTRIFUGATION.25
3.11.2. PROTEINBESTIMMUNG NACH
BRADFORD (1976).25
3.11.3. DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).26
3.11.4. COOMASSIE BRILLANT BLUE PROTEINFAERBUNG.26
3.11.5. WESTERN-BLOT ANALYSE.27
3.11.6. FAR-WESTERN ANALYSE. 28
3.12. CHARAKTERISIERUNG GEREINIGTER PROTEINE.29
3.12.1. AKTIVITAETSTEST DER DNA-POLYMERASE A.29
3.12.2. DETEKTION VON 3'-5' EXONUKLEASEAKTIVITAET.30
3.12.3. SV40
IN VITRO REPLIKATION.32
3.12.4. "ELEKTROPHORESIS MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA)" NACH
HUPP & LANE, 1994.33
3.12.5. NATIVE TBE-POLYACRYLAMIDGELEKTROPHORESE (NACH
HUPP ET AL. 1992).34
3.12.6. RELAXIERUNG VON SUPERCOILED PLASMIDEN MIT TOPOISOMERASE I
(ANDERSEN
ET AL., 1985).34
3.13. KLONIERUNGSMETHODEN. 35
3.13.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER
ESCHERICHIA COLI.35
3.13.2. TRANSFORMATION VON
ESCHERICHIA COLI.35
3.13.3. GEWINNUNG VON PLASMID-DNA.35
3.13.4. DNA-RESTRIKTIONSANALYSE.37
3.13.5. DNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE. 37
3.13.6. ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.38
3.13.7. AMPLIFIKATION VON DNA MIT PCR.38
3.13.8. LIGATION VON DONOR- UND VEKTOR-DNA.38
3.13.9. HERSTELLUNG REKOMBINANTER BACULOVIREN.38
4. ERGEBNISSE.40
4.1. EXPRESSION UND REINIGUNG VON REKOMBINANTEM TP53 AUS VERSCHIEDENEN
EXPRESSIONS
SYSTEMEN .40
4.1.1. KLONIERUNG DES BP53 IN VERSCHIEDENE EXPRESSIONSVEKTOREN.40
4.1.2. EXPRESSION UND REINIGUNG DES GST-BTP53 FUSIONSPROTEINS.43
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.1.3. EXPRESSION UND REINIGUNG VON HIS-TP53 FUSIONSPROTEINEN.44
4.1.4. KONVENTIONELLE REINIGUNG VON TP53.45
4.2. CHARAKTERISIERUNG DER TP53 VERSCHIEDENER SPEZIES.46
4.2.1. SEQUENZSPEZIFISCHE DNA-BINDUNG.46
4.2.2. EXONUKLEASEAKTIVITAET.48
4.2.3. EINFLUSS AUF DIE SV40
IN VITRO DNA-REPLIKATION. 50
4.3. WECHSELWIRKUNGEN REKOMBINANTEN TP53 MIT AUSGEWAEHLTEN
REPLIKATIONSPROTEINEN.53
4.3.1. BEEINFLUSSUNG DER AKTIVITAET VON TOPOISOMERASE I DURCH TP53.53
4.3.2. UNTERSUCHUNG VON PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN MIT FAR-WESTERN
ANALYSEN.54
4.4. WECHSELWIRKUNGEN REKOMBINANTER POLYMERASE A-PRIMASE MIT TP53.58
4.4.1. SEDIMENTATION IM ISOKINETISCHEN DICHTEGRADIENTEN.58
4.4.2. IMMUNAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.27.60
4.4.3. KONVENTIONELLE REINIGUNG.64
4.5. UNTERSUCHUNG BOVINER POL A-PRIM AUS KALBSTHYMUS AUF INTERAKTION MIT
TP53.67
4.6. REINIGUNG VON HUMANER POL A-PRIM UND TP53 AUS HSC 93 ZELLEN.69
5. DISKUSSION.72
5.1. DIE ROHE VON TP53 IN ZELLULAEREN PROZESSEN.72
5.2. FUNKTIONALE CHARAKTERISIERUNG VERSCHIEDENER REKOMBINANTER TP53.74
5.2.1. REINIGUNG.74
5.2.2. SEQUENZSPEZIFISCHE DNA-BINDUNG VON TP53.74
5.2.3. DIE 3'-5' EXONUKLEASEAKTIVITAET VON TP53.76
5.3. WECHSELWIRKUNG VON TP53 MIT REPLIKATIVEN PROTEINEN.77
5.3.1. NETZWERK DER PROTEIN-PROTEIN WECHSELWIRKUNGEN REPLIKATIVER
PROTEINE.78
5.3.2. WECHSELWIRKUNG VON TP53 MIT DEM SV40 GROSSEN TAG. 79
5.3.3. WECHSELWIRKUNG VON TP53 MIT DEM EINZELSTRANGBINDEPROTEIN RPA.80
5.3.4. POTENTIELLE INTERAKTION VON TP53 MIT DER POLYMERASE A-PRIMASE.81
5.4. INTERAKTION DES TUMORSUPPRESSORPROTEINS P53 MIT TOPOISOMERASE 1.85
5.5. PERSPEKTIVEN.86
6. ZUSAMMENFASSUNG.89
7. LITERATURVERZEICHNIS
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