Neuronaler Zelltod bei der Alzheimer-Demenz: Einfluss von b-Amyloid [Beta-Amyloid] und Amyloid-precursor-Protein
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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
I.EINLEITUNG
1.1 Alzheimer Demenz 1
1.1.1 Definition, Epidemiologie und klinisches Bild 1
1.1.2 Pathologische Merkmale 4
1.1.3 Ätiologie 5
1.1.3.1 Alter 5
1.1.3.2 Genetische Faktoren 5
1.1.4 Rolle von APP und ß Amyloid bei der Alzheimer Demenz 9
1.1.4.1 Prozessierung von APP 9
1.1.4.2 ß Amyloid 12
1.1.5 Bedeutung von oxidativem Stress 13
1.2 Zelltod in neurodegenerativen Erkrankungen 15
1.2.1 Apoptose 15
1.2.1.1 Mechanismus der Apoptose 16
1.2.1.2 Beteiligung der Apoptose an neurodegenerativen Prozessen 19
1.2.2 Nekrose 21
1.3 Zellkulturen als Modellsysteme 22
1.3.1 Pro und Contra von Zellkulturmodellen 22
1.3.2 Phäochromozytom Zellen der Ratte (PC12 Zellen) 24
1.3.2.1 Herkunft und Eigenschaften 24
1.3.2.2 Bisherige Untersuchungen an PC12 Zellen über neurodegenerative
Prozesse 25
1.4 Ziele der Arbeit 26
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material 29
2.1.1 Geräte und Materialien 29
2.1.2 Chemikalien 30
2.1.3 Kits 32
2.1.4 Puffer und Lösungen 32
Inhaltsverzeichnis
35
2.2 Zellkultur
2.3 Quantifizierung des Zelltodes
39
2 3.1 MTT Assay 40
2.3.2 LDH Assay 41
2.3.3 Trypanblau Färbung 2.4 TUNEL FÄRBUNG 4
2.4.1 Durchführung der TUNEL Färbung an undifferenzierten PC12 Zellen 43
2.4.2 Durchführung der TUNEL Färbung an ausdifferenzierten PC12 Zellen 45
2.5 Bestimmung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
45
2.5.1 Apparatur 46
2.5.2 Durchführung 2.6 Messung der Membranfluidität
2.6.1 Apparatur 2.6.2 Durchführung 2.6.2.1 Kulturbedingungen und Zellisolation 50
2.6.2.2 Membranpräparation 52
2.6.2.3 Anisotropie Bestimmung 2.7 Bestimmung des Proteingehaltes
2.8 beta Amyloid Peptide
¦53
2.9 Statistische Auswertung
3. ERGEBNISSE
3.1 Methodenetablierung
3.1.1 Etablierung des Zytotoxizitätsassays (MTT Assay) an PC12 Zellen 55
3.1.2 Etablierung des Zelltodquantifizierung (LDH Assay) 3.1.3 Etablierung der TUNEL Färbung 59
3.1.4 Etablierung der Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies 3.1.5 Etablierung der Anisotropiemessung 64
3.2 Charakterisierung der H2O2 Toxizität
3.2.1 MTT Assay 65
Inhaltsverzeichnis
3.2.2 LDH Assay 66
3.2.3 TUNEL Assay 67
3.3 Charakterisierung der Staurosporin Toxizität 69
3.3.1 MTT Assay 70
3.3.2 LDH Assay 70
3.3.3 TUNEL Assay 71
3.4 Charakterisierung der biologischen Effekte von ij Amyloid 73
3.4.1 MTT Assay 75
3.4.2 Geschwindigkeit der MTT Formazanbildung unter Aß Behandlung 76
3.4.3 LDH Assay 77
3.4.4 Trypanblau Färbung 78
3.4.5 Effekt von ß Amyloid auf die Membranfluidität von PC12 Zellen 79
3.5 Toxische Effekte von Cholesterol 81
3.5.1 Modulation des zellulären Cholesterolgehaltes 82
3.5.2 Charakterisierung der Cholesterol MßCD induzierten Toxizität 83
3.5.3 Einfluss von ß Amyloid und Cholesterol auf die Exozytose von MTT Formazan .... 84
3.6 Einfluss der Expression von APPwt / APPsw auf die zelluläre
Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Stressoren 87
3.6.1 In v/fro Spontanapoptose in undifferenzierten PC12 Zellen 89
3.6.2 In wfro Spontanapoptose in ausdifferenzierten PC12 Zellen 90
3.6.3 H2O:Hnduzierter Zelltod in APPwt / APPsw exprimierenden PC12 Zellen 92
3.6.3.1 MTT Assay 93
3.6.3.2 LDH Assay 94
3.6.3.3 TUNEL Assay 95
3.6.3.4 H2O2 und Fe2* induzierte reaktive Sauerstoffspezies 96
3.6.4 Staurosporin induzierter Zelltod in APPwt / APPsw exprimierenden PC12 Zellen. 99
3.6.4.1 MTT Assay 100
3.6.4.2 LDH Assay 101
3.6.4.3 TUNEL Assay 102
3.6.5 Einfluss der Expression von APPwt / APPsw auf die biologischen Effekte von ß
Amyloid 104
3.6.5.1 MTT Assay 105
3.6.5.2 LDH Assay 107
3.6.5.3 TUNEL Assay 108
Inhaltsverzeichnis
3 6 5.4 Einfluss von APPwt / APPsw auf die Aß induzierte Membranrigidisierung 109
4. DISKUSSION
4.1 Effekte von r Amyloid auf PC12 Zellen 111
4.1.1 Zelltoxische Effekte von ß Amyloid 112
4.1.2 ß Amyloideffekte auf die Zellmembran 117
4.1.3 Einfluss der APPwt und APPsw Expression auf die ß Amyloideffekte 119
4.2 Beteiligung von Cholesterol an der Pathogenese der Alzheimer Demenz 120
4.3 Einfluss der APPwt und APPsw Expression auf die Zelltod regulation in
PC12 ZELLEN 123
4.3.1 Spontanapoptose Einfluss der Serumkonzentration 124
4.3.2 Stress induzierte Apoptose 126
4.3.2.1 Zelltod durch oxidativen Stress 127
4.3.2.2 Staurosporin induzierter Zelltod 129
S.ZUSAMMENFASSUNG 133
LITERATURVERZEICHNIS 135
PUBLIKATIONEN
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
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