Identifizierung differentiell exprimierter Gene in Tumor- und Endothelzellen des humanen Nierentumors:
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| Format: | Buch |
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG. 1
1.1 GRUNDLAGEN DER TUMORENTWICKLUNG. 1
1.2 TUMORANGIOGENESE. 4
1.3 INHIBITION DER TUMORANGIOGENESE. 8
1.4 METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER DIFFERENTIELLEN GENEXPRESSION. 10
1.5 ZIELE DER ARBEIT. 12
2 MATERIAL. 14
2.1 CHEMIKALIEN, BIOLOGISCHE REAGENZIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL. 14
2.2 ENZYME. 15
2.3 ANTIKOERPER. 15
2.3.1 WESTEM-BLOT-ANALYSE. 15
2.3.2 FACS-ANALYSE. 15
2.3.3 IMMUNOMAGNETISCHE ZELLSORTIERUNG. 16
2.3.4 IMMUNHISTOCHEMIE. 16
2.4 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE. 17
2.4.1 IN SITU HYBRIDISIERUNG. 17
2.4.2 RACE-TECHNOLOGIE. 17
2.5 RADIOCHEMIKALIEN. 17
2.6 PHOTOMATERIALIEN. 17
2.7 PROTEIN UND DNA-GROESSENSTANDARDS. 18
2.8 GEWEBE PROBEN. 18
2.9 ZELLKULTUR. 18
2.9.1 ZELLEN. 18
2.9.2 KULTURMEDIEN. 18
2.9.3 MEDIENZUSAETZE. 19
2.9.4 SEREN, PUFFERLOESUNGEN. 19
2.9.5 WACHSTUMSFAKTOREN. 19
2.10 SPEZIELLE GERAETE. 19
2.11 ANALYSESOFTWARE UND DATENBANKEN AUS DEM INTERNET. 19
3 METHODEN. 21
3.1 ZELLBIOLOGIE. 21
3.1.1 ISOLIERUNG VON ENDOTHELZELLEN AUS DER NABELSCHNUR. 21
3.1.2 ISOLIERUNG VON ENDOTHELZELLEN UND FIBROBLASTEN AUS HUMANER HAUT.
21
3.1.3 ISOLIERUNG VON ENDOTHELZELLEN AUS HUMANEM NIEREN- UND
NIERENTUMORGEWEBE. 22
3.1.4 KULTIVIERUNG DER ZELLEN. 23
3.1.5 IMMUNOMAGNETISCHE ZELLSORTIERUNG. 23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHN IS
3.1.6 FACS-ANALYSE
(FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING). 25
3.1.7 TEST AUF CHEMOTAKTISCHE AKTIVITAET. 26
3.1.8 MESSUNG DER MITOGENEN AKTIVITAET. 27
3.1.9 ZELLAUFSCHLUSS. 27
3.2 BIOCHEMISCHE METHODEN. 28
3.2.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN. 28
3.2.2 IMMUNPRAEZIPITATION. 28
3.2.3 DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE). 28
3.2.4 WESTERN BLOT ANALYSE. 29
3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN. 30
3.3.1 AUFREINIGUNG VON GESAMT-RNA. 30
3.3.2 AUFREINIGUNG VON MRNA. 31
3.3.3 NORTHERN BLOT ANALYSE. 32
3.3.4 PRAEPARATION VON CDNA. 34
3.3.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 35
3.3.6 KOLONIE-PCR. 35
3.3.7 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN. 36
3.3.8 AGAROSEGEL-ELEKROPHORESE. 36
3.3.9 SOUTHEM/REVERSE NORTHERN BLOT ANALYSE. 37
3.3.10 SLOT-BLOTTING. 38
3.3.11 LIGATION. 38
3.3.12 TRANSFORMATION UND PLATTIERUNG. 38
3.3.13 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA. 39
3.3.14 DNA-SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN. 39
3.3.15 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN. 39
3.3.16 SUPPRESSION SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION (SSH). 40
3.3.17 SEQUENZIERUNG VON DNA. 43
3.3.18 DATENBANK-SUCHE NACH SEQUENZHOMOLOGIEN. 43
3.3.19 VERVOLLSTAENDIGEN EINER CDNA-SEQUENZ DURCH RACE-TECHNOLOGIE
(RAPID AMPLIFICATION OF 5
' AND 3 ' CDNA ENDS). 44
3.4 HISTOLOGISCHE METHODEN. 47
3.4.1 ANFERTIGUNG VON KRYOGEWEBS-SCHNITTEN. 47
3.4.2 FIXIERUNG DER KRYOGEWEBS-SCHNITTE. 47
3.4.3 FLUORESZENZ-FAERBUNG. 47
3.4.4 ABC-FAERBUNG. 48
3.4.5 IN SITU HYBRIDISIERUNG. 49
4 ERGEBNISSE. 52
4.1 KULTIVIERUNG PRIMAERER ENDOTHELZELLEN UND FIBROBLASTEN AUS HUMANEN
GEWEBEN. 52
4.1.1 ETABLIERUNG DER ISOLIERUNGSMETHODEN. 52
4.1.2 ISOLIERUNG VON ENDOTHELZELLEN UND FIBROBLASTEN AUS DER HAUT. 54
4.1.3 ISOLIERUNG VON ENDOTHELZELLEN AUS NIEREN- UND NIERENTUMORGEWEBE.
55
INHALTSVERZEICHNIS
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER KULTIVIERTEN ENDOTHELZELLEN. 56
4.2.1 MORPHOLOGIE DER ENDOTHELZELLEN. 56
4.2.2 CHEMOTAKTISCHE AKTIVITAET DER ENDOTHELZELLEN. 57
4.2.3 MITOGENE AKTIVITAET DER ENDOTHELZELLEN. 57
4.2.4 EXPRESSION VON ENDOTHELZELL-SPEZIFISCHEN OBERFLAECHENANTIGENEN. 58
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER KULTIVIERTEN FIBROBLASTEN. 62
4.4 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE GENE IM ENDOTHEL DES NIERENTUMORS UND IM
NIERENTUMORGEWEBE. 64
4.4.1 UEBERPRUEFUNG PRAEPARIERTER CDNA. 64
4.4.2 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE GENE IM ENDOTHEL DES NIERENTUMORS. 65
4.4.2.1 UEBERBLICK DER ERGEBNISSE. 65
4.4.2.2 HERSTELLUNG EINER SUBTRAHIERTEN CDNA-BANK DURCH
SUPPRESSION
SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION. 66
4.4.2.3 KLONIERUNG DER SUBTRAHIERTEN CDNA IN E.COLI. 67
4.4.2.4 UEBERPRUEFUNG DER CDNA-BANK AUF DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE KLONE.
68
4.4.2.5 VERIFIZIERUNG DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER KLONE. 70
4.4.2.6 NEGATIV SCREENING DER DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN KLONE. 71
4.4.2.7 SEQUENZIERUNG UND DATENBANKANALYSE. 72
4.4.2.8 DIFFERENTIELLE EXPRESSION DER IDENTIFIZIERTEN CDNAS IN
UNTERSCHIEDLICHEN
MATCHEDPAIRS
AUS NIERE UND NIERENTUMOR. 73
4.4.2.9 ZUSAMMENFASSUNG DER SUCHE DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER GENE IM
ENDOTHEL DES NIERENTUMORS. 77
4.4.3 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE GENE IM NIERENTUMOR. 78
4.4.3.1 UEBERBLICK DER ERGEBNISSE. 78
4.4.3.2 HERSTELLUNG EINER SUBTRAHIERTEN CDNA-BANK DURCH
SUPPRESSION
SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION
. 79
4.4.3.3 KLONIERUNG DER SUBTRAHIERTEN CDNA IN E.COLI. 79
4.4.3.4 UEBERPRUEFUNG DER CDNA-BANK AUF DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE KLONE.
79
4.4.3.5 NEGATIV SCREENING UND VERIFIZIERUNG DER DIFFERENTIELLEN
EXPRESSION. 81
4.4.3.6 SEQUENZIERUNG UND DATENBANKANALYSE. 81
4.4.3.7 DIFFERENTIELLE EXPRESSION DER IDENTIFIZIERTEN CDNAS IN
UNTERSCHIEDLICHEN
MATCHED PAIRS
AUS NIERE UND NIERENTUMOR. 83
4.4.3.8 ZUSAMMENFASSUNG DER SUCHE DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER GENE IM
GEWEBE DES NIERENTUMORS. 86
4.5 EXPRESSIONSANALYSE VON CD24 UND OSTEOPONTIN. 87
4.5.1 IMMUNHISTOCHEMIE. 87
4.5.2 IN SITU HYBRIDISIERUNG. 90
4.6 SRIG1 (,JSMALL RENAL CELL CARCINOMA INDUCED GENE 7"). 93
4.6.1 EXPRESSION DER MRNA IN
MATCHED PAIRS AUS NIERE UND NIERENTUMOR. 93
4.6.2 IN SITU HYBRIDISIERUNG. 95
4.6.3 IDENTIFIZIERUNG DER VOLLSTAENDIGEN CDNA-SEQUENZ. 96
4.6.4 CHARAKTERISIERUNG VON SRIG1.100
4.6.4.1 DIE CDNA-SEQUENZ. 100
4.6.4.2 POTENTIELLE AMINOSAEURE-SEQUENZEN VON SRIG1. 100
INHALTSVERZEICHNIS
5 DISKUSSION.103
5.1 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ENDOTHELZELLEN AUS HUMANEM
NIEREN-
UND NIERENTUMORGEWEBE.103
5.2 SUCHE NACH DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN GENEN IN ISOLIERTEN
ENDOTHELZELLEN AUS
HUMANEM NIERENTUMORGEWEBE.105
5.3 SUCHE NACH DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN GENEN IM NIERENTUMOR.110
5.4 AUSBLICK.115
6 ZUSAMMENFASSUNG.117
7 LITERATUR.118
8 ANHANG. 130 |
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