Signaltransduktion von Abscisinsäure in Arabidopsis thaliana: transiente Expression in Protoplasten als Modellsystem
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INHALT
1
INHALT
ABKUERZUNGEN 4
ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 6
1
EINLEITUNG 8
1.1. PFLANZENHORMONE UND SIGNALTRANSDUKTION 8
1.2. SIGNALTRANSDUKTION VON ABSCISINSAEURE 10
1.2.1. GENETISCHE ANALYSE 11
1.2.2. GENREGULATION 14
1.2.3. STOMATAREGULATION 15
1.2.4. TRANSIENTE EXPRESSION 17
1.3. ZIELE DER ARBEIT 19
2.
MATERIAL UND METHODEN 20
2.1. MATERIALIEN 20
2.1.1. PFLANZEN 20
2.1.2. MIKROORGANISMEN 20
2.1.3. PLASMID VEKTOREN 21
2.1.4. ENZYME 22
2.1.5. CHEMIKALIEN 22
2.2. METHODEN 23
2.2.1. ANZUCHT VON
ARABIDOPSIS THALIANA 23
2.2.2. KLONIERUNGSTECHNIKEN 23
2.2.3. SOUTHERN 24
2.2.3.1. DNA-TRANSFER AUF NYLON-MEMBRANEN 24
2.2.3.2. HERSTELLUNG VON RADIOAKTIV MARKIERTEN DNA-SONDEN 24
2.23.3. DNA-DNA-HYBRIDISIERUNG 24
2.2.4. NORTHERN UND RT-PCR 25
2.2.4.1. RNA-ISOLATION 25
2.2.4.2. NORTHERN BLOT 25
2.2.4.3. DIG-MARKIERTE DNA-SONDE 26
2.2.4.4. HYBRIDISIERUNG 26
2.2.4.5. IMMUNDETEKTION 27
2.2.4.6. REVERSE TRANSKRIPTION VON RNA UND RT-PCR 27
2.2.5.
IN PLANTA TRANSFORMATION VON ARABIDOPSIS THALIANA / SCREENING 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALT
2
2.2.5.1. ANALYSE VON TRANSGENEN PFLANZEN 29
2.2.6. KREUZUNGEN 30
2.2.7. TRANSIENTE EXPRESSION IN
ARABIDOPSIS PROTOPLASTEN 30
2.2.7.1. DNA-ISOLATION FUER TRANSIENTE EXPRESSION 30
2.2.7.2. PROTOPLASTIERUNG 31
2.2.7.3. TRANSFEKTION UND KULTIVIERUNG DER PROTOPLASTEN 32
2.2.7.4. EXTRAKTION 33
2.2.8. AKTIVITAETSNACHWEIS VON REPORTERGENEN 34
2.2.8.1. SS-D-GLUCURONIDASE 34
2.2.8.2.
PHOTINUS PYRALIS LUCIFERASE 35
2.2.8.3. AEQUORIN 36
2.2.8.4.
GREEN FLUORESCENT PROTEIN 36
2.2.9. MEMBRANPOTENTIALMESSUNG AN WURZELZELLEN 36
3. ERGEBNISSE 39
3.1.
ETABLIERUNG EINES TRANSIENTEN EXPRESSIONSSYSTEMS ZUR ANALYSE
DER ABA-SIGNALTRANSDUKTION 39
3.1.1. PROTOPLASTIERUNG UND KULTIVIERUNG DER PROTOPLASTEN 39
3.1.2. EXPRESSION VON REPORTERGENEN IN
ARABIDOPSIS PROTOPLASTEN 41
3.1.3. INTERNE STANDARDS FUER DIE TRANSIENTE EXPRESSION 42
3.1.4. ZEITABHAENGIGE EXPRESSION DER STANDARDS 46
3.1.5. REPRODUZIERBARKEIT DES SYSTEMS 47
3.2. ABA VERMITTELTE GENREGULATION 49
3.2.1. BEISPIELE FUER TRANSKRIPTIONEILE REGULATION DURCH ABA 49
3.2.2. ABA-REGULIERTE PROMOTOR-REPORTERGENFUSIONEN FUER DIE TRANSIENTE
EXPRESSION 53
3.2.3. ZEIT- UND ABA- ABHAENGIGE EXPRESSION 58
3.3. MODELLSYSTEM ZUM VERGLEICH VON MUTANTEN UND WILDTYP 63
3.3.1. ABA-ABHAENGIGE EXPRESSION VON REPORTERGENEN IN
MUTANTEN UND WILDTYPPROTOPLASTEN 63
3.4. EKTOPISCHE EXPRESSION VON EFFEKTOREN 82
3.4.1. COTRANSFEKTION VON ABU UND DERIVATEN 82
3.4.2. EINFLUSS AUF DIE ABA REGULATION 84
3.4.3. EXPRESSION VON ABU UND ABI1 IN
AHR1- UND GCA2-PROTOPLASTEN 86
3.4.4. UEBEREXPRESSION VON ABI2 UND DERIVATEN 89
3.4.5. ATHB-6, EIN ABA REGULIERTER HD-ZIP TRANSKRIPTIONSFAKTOR 92
3.4.6. TRANSKRIPTIONELLE REGULATION EINES KUENSTLICHEN PROMOTORS
DURCH ATHB-6 95
3.4.7. ABU ALS EFFEKTOR DER DURCH ATHB-6 VERMITTELTEN TRANSKRIPTIONEILEN
REGULATION 100
INHALT
3
3.5. LOKALISATION VON FUSIONSPROTEINEN IN PROTOPLASTEN 102
3.6. COTRANSFEKTION VON COSMIDEN IM TRANSIENTEN EXPRESSIONSSYSTEM 108
3.7. TRANSGENE REPORTERLINIEN 110
3.7.1. VERGLEICH DER GENREGULATION IM TRANSIENTEN SYSTEM UND
IN STABILEN REPORTERLINIEN 111
3.7.2. KREUZUNGEN DER REPORTERLINIEN MIT ABA HYPERSENSITIVEN BZW.
INSENSITIVEN MUTANTEN UND TRANSGENEN 114
3.8. MEMBRANPOTENTIALMESSUNGEN 116
4. DISKUSSION
119
4.1 TRANSIENTE EXPRESSIONSSTUDIEN EIN MODELLSYSTEM? 119
4.2. ABA-SIGNALTRANSDUKTION 131
5. LITERATUR
142
6. ANHANG
154
CURRICULUM VITAE
PUBLIKATIONEN |
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