Regulation von MAPK-Signalwegen durch die Serin-Threonin-Kinase MLK3:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. SUMMARY. 1
1. ZUSSAMENFASSUNG. 2
2. EINLEITUNG
2.1. MAP KINASE SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADEN. 3
2.2. STRUKTUR, REGULATION UND FUNKTION DES ERK SIGNALWEGS. 4
2.3. STRESS-AKTIVIERTE MAP KINASEN. 7
2.3.1. JNK/SAPK. 7
2.3.2. P38. 9
2.4. DIE ROLLE VON RAS UND RHO GTPASEN IN DER ZELLTRANSFORMATION. 10
2.5. FUNKTIONEN VON JNK/SAPK-GESTEUERTEN SIGNALWEGEN IN DER APOPTOSE. 13
2.6. MAPKKKS OBERHALB VON STRESS-AKTIVIERTEN MAP KINASE KASKADEN. 14
2.7. MIXED LINEAGE KINASEN. 15
2.8. REGULATION DER MIXED LINEAGE KINASEN. 16
2.9. SPEZIFITAET BEI DER SIGNALTRANSDUKTION DURCH MAP KINASEN. 17
2.10. FRAGESTELLUNGEN. 18
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1. ARBEITSMATERIAL
3.1.1. CHEMIKALIEN UND RADIOAKTIVE VERBINDUNGEN. 19
3.1.2. ZELLKULTURMATERIAL. 20
3.1.3. ENZYME. 20
3.1.4. GROESSENMARKER. 21
3.1.5. ANTIKOERPER. 21
3.1.6. REKOMBINANTE PROTEINE. 21
3.1.7. REAGENZIENSAETZE. 22
3.1.8. PLASMIDE. 22
3.1.9. ZELLINIEN UND BAKTERIENSTAEMME. 24
3.1.10. GERAETE. 24
3.2. ARBEITSMETHODEN
3.2.1. BAKTERIENKULTUREN. 24
3.2.2. BESTIMMUNG DER DNA KONZENTRATION. 25
3.2.3. KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSPLASMIDEN. 25
3.2.4. SEQUENZANALYSE VON DNA. 27
3.2.5. MAXIPRAEPARATION VON PLASMID DNA. 28
3.2.6. BAKTERIELLE EXPRESSION UND AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE.
28
3.2.7. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION. 29
3.2.8. EINDIMENSIONALE SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE. 29
3.2.9. IMMUNOBLOT. 30
3.2.10. ZELLKULTUR: HALTUNG EUKARYOTISCHEN ZELLINIEN IN KULTUR. 31
3.2.11. TRANSIENTE TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN. 32
3.2.12. HERSTELLUNG STABILER ZELLINIEN. 32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.2.13. SOFT-AGAR KLONIERUNG. 33
3.2.14. IN VIVO PHOSPHOMARKIERUNG VON HELA ZELLEN. 33
3.2.15. IMMUNPRAEZIPITATION. 33
3.2.16. "IN VITRO" KINASE-ASSAY. 34
3.2.17. LUCIFERASE TEST. 34
3.2.18. SS-GALAKTOSIDASE TEST. 35
4. ERGEBNISSE
4.1. IDENTISSZIERUNG INTRAZELLULAERER MAPK KASKADEN, DIE DURCH MLK3
AKTIVIERT WERDEN
4.1.1. MLK3 AKTIVIERT DIE TRANSKRIPTION VON AP- 1/ETS-ABHAENGIGEN
PROMOTOREN. 36
4.1.2. UEBEREXPRESSION VON MLK3 FUEHRT ZUR RAF-UNABHAENGIGEN AKTIVIERUNG
DER
MAPK ERK 1. 37
4.1.3. MLK3-INDUZIERTE ERK AKTIVIERUNG IST ABHAENGIG VON MEK. 39
4.1.4. MLK3 AKTIVIERT DIE MAPK JNK/SAPK. 40
4.1.5. MLK3 PHOSPHORYLIERT MEK1 UND SEK1 IN VITRO. 41
4.1.6. MLK3 IST EIN SCHWACHER MEK-, ABER EIN STARKER SEK-AKTIVATOR. 43
4.1.7. ENGE KORRELATION ZWISCHEN MLK3 VERMITTELTER MEK1 SUBSTRAT
PHOSPHORYLIERUNG IN VITRO UND MEK 1/2 PHOSPHORYLIERUNG AUF SER
217/221. 44
4.1.8. MLK3 PHOSPHORYLIERT MEK1/2
IN VIVO. 45
4.1.9. MODULATION VON MLK3-VERMITTELTER ERK AKTIVIERUNG DURCH MEK1
MUTANTEN. 47
4.1.10. MLK3 BLOCKIERT DIE ASSOZIATION VON MEK MIT ERK. 50
4.1.11. MLK3-PHOSPHORYLIERTES ENDOGENES MEK1/2 IST INAKTIV. 51
4.1.12. ILLSS UND ANDERE JNK/SAPK AKTIVATOREN ENTKOPPELN MEK PHOSPHO
RYLIERUNG VON ERK AKTIVIERUNG IN VIVO. 53
4.1.13. MLK3 AKTIVIERUNG DURCH DIE RHO GTPASEN CDC42 UND RAC 1 FUEHRT ZU
JNK/SAPK AKTIVIERUNG UND EINER VON ERK ENTKOPPELTEN MEK
PHOSPHORYLIERUNG. 55
4.2. UEBEREXPRESSION VON WILD TYP MLK3 TRANSFORMIERT NIH 3T3
FIBROBLASTEN
4.2.1. NIH 3T3 FIBROBLASTEN, DIE MLK3 UEBEREXPRIMIEREN, SIND
MORPHOLOGISCH
TRANSFORMIERT UND BILDEN KOLONIEN IN SOFT AGAR. 57
4.2.2. MEK UND C-JUN SIND KONSTITUTV PHOSPHORYLIERT IN
MLK3-TRANSFORMIERTEN
NIH 3T3 FIBROBLASTEN. 60
4.2.3. DER MEK INHIBITOR PD 098059 REVERTIERT DIE TRANSFORMIERTE
MORPHOLOGIE
MLK3-EXPRIMIERENDER NIH 3T3 FIBROBLASTEN PARTIELL. 62
4.2.4. SYNERGISTISCHE FOCIBILDUNG DURCH MLK3 UND AKTIVIERTER MEK1. 63
4.2.5. REDUZIERTE ERK1/2 AKTIVIERUNG DURCH MITOGENE STIMULI IN MLK3-
TRANSFORMIERTEN ZELLEN. 65
4.2.6. MLK3 INDUZIERTE MEK PHOSPHORYLIERUNG BLOCKIERT WACHSTUMSFAKTOR
INDUZIERTE MEK AKTIVIERUNG. 67
5. DISKUSSION
5.1. MLK3 AKTIVIERT JNK/SAPK UND PHOSPHORYLIERT UND ENTKOPPELT
GLEICHZEITIG DIE MAPK KINASEN MEK1/2 VON ERK1/2 AKTIVIERUNG. 69
5.2. IN MLK3 TRANSFORMIERTEN NIH 3T3 FIBROBLASTEN IST WACHSTUMSFAKTOR
INDUZIERTE ERK AKTIVIERUNG BLOCKIERT. 74
6. LITERATURANGABEN. 79
ANHANG
ABKUERZUNGEN. 93
DANKSAGUNG. 94
CURRICULUM VITAE. 95
PUBLIKATIONSVERZEICHNIS. 96 |
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