Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG.1
2. EINLEITUNG.5
2.1. BIOFILMBILDUNG BEI STAPHYLOKOKKEN ALS PATHOMEEHANISMUS.5
2.1.1. ALLGEMEINES.5
2.1.2. PRIMAERE BINDUNG VON STAPHYLOKOKKEN AN POLYMEROBERFLAECHEN.7
2.1.3. FAKTOREN FUER DIE BIOFILMBILDUNG IN 5.
EPIDERMIDIS.9
2.1.4. BIOFILMBILDUNG IN
S. AUREUS.11
2.2. ANTIBIOTIKARESISTENZ BEI STAPHYLOKOKKEN UND DER EINFLUSS VON
BIOFILMEN
AUF DIE ANTIBIOTIKARESISTENZ.12
2.2.1. ANTIBIOTIKARESISTENZ.12
2.2.2. DER EINFLUSS VON BIOFILMEN AUF DIE RESISTENZ.13
2.3. PHAENOTYPISCHE UND GENOTYPISCHE VARIABILITAET.14
2.4. GENREGULATION IN STAPHYLOKOKKEN.15
2.4.1. AGR (ACCESSORY GENE REGULATOR)-SYSTEM IN
S. AUREUS UND S. EPIDERMIDIS.16
2.4.2. SAR (STAPHYLOCOCCAL ACCESSORY REGULATOR)-SYSTEM IN
S. AUREUS.17
2.4.3. DER ALTERNATIVE SIGMA-FAKTOR SIGB IN
S. AUREUS.18
3. MATERIAL. 22
3.1. BAKTERIENSTAEMME.22
3.2. OLIGONUKLEOTIDE.22
3.3. CHEMIKALIEN.24
3.4. GERAETE UND SONSTIGES.25
3.5. MEDIEN UND AGARPLATTCN.26
3.6. PUFFER UND LOESUNGEN.27
3.7. DNA-UND RNA-GROESSCNMARKCR.28
3.7.1. DNA-GROESSCNMARKCR.28
3.7.2. RNA-GROESSCNMARKCR.29
3.8. ANTIBIOTIKA-TCSTBLAEUEHCN.29
4. METHODEN.^0
4.1. ISOLIERUNG DER STAPHYLOKOKKEN AUS DER NASE UND SPEZIFISCHE
IDENTIFIZIERUNG.30
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/964235102
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.1. NASENABSTRICH (,,TRANSWAB"-KIT).30
4.1.2. KATALASE-TEST.30
4.1.3. KOAGULASE-TEST MIT DEM YYSTAPHYTECT PLUS"-KIT.30
4.1.4. API-STAPH-TEST.30
4.2. ANTIBIOTIKARESISTENZ-TEST (KIRBY-BAUER-TEST).31
4.3. BIOFILM-TEST.32
4.4. HERSTELLUNG VON VARIANTENSTAEMMEN FUER DIE BIOFILMBILDUNG.32
4.5. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION).33
4.6. REINIGUNG VON PCR-PRODUKT MIT YYQIAQUICK
YY
SPIN"-KIT.33
4.7. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.34
4.8. PHENOLISIERUNG VON PLASMID-DNA.34
4.9. ALKOHOLISCHE FAELLUNG VON DNA.34
4.10. SPALTUNG VON PLASMID-DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN.35
4.11. SPALTUNG VON CHROMOSOMALER DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN.35
4.12. HORIZONTALE GELELEKTROPHORESE.35
4.13. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE-GELEN (YYGENE
CLEAN"-KIT).36
4.14. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA.36
4.14.1. SCHNELLLYSAT-METHODE MIT DIATOMENERDE.36
4.14.2. QIAGEN MIDI-PRAEPARATION (QIAGEN PLASMID-HANDBUCH, 2000).37
4.15. ISOLIERUNG VON CHROMOSOMALER DNA.38
4.16. SOUTHEM-HYBRIDISIERUNG.39
4.16.1. GELELKTROPHORESE.39
4.16.2. VAKUUMBLOTTEN.39
4.16.3. MARKIERUNG DER DNA-SONDE UND HYBRIDISIERUNG (,,ECL"-KIT).40
4.17. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS STAPHYLOKOKKEN (,,FASTRNA"-KIT).41
4.18. NORTHEM-HYBRIDISIERUNG.41
4.18.1. RNA-GELELEKTROPHORESE.41
4.18.2. NORTHEM-BLOT.42
4.19. UNTERSUCHUNG DER GESAMTPROTEINE.43
4.19.1. GEWINNUNG VON BAKTERIELLEN GESAMTZELLYSATEN
DURCH LYSE MIT LAEMMLI-PUFFER.43
4.19.2. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE).43
4.19.3. FAERBEN VON PROTEINGELEN MIT COOMASSIE-BLAU.44
4.20. IMMUNOBLOT GEGEN PIA.45
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.21. SEQUENZIERUNG VON DNA (FLUORESZENZ-METHODE
YYTHERMOSEQUENASE"-KIT).46
4.22. PFGE (PULSFELDGELELKTROPHORESE).46
4.22.1. ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS STAPHYLOKOKKEN FUER DIE
PFGE.46
4.22.2. RESTRIKTIONSENDONUKLEASESPALTUNG VON GENOMISCHER DNA
IM AGAROSEBLOECKCHEN.47
4.22.3. PULSFELDGELELKTROPHORESE MIT DEM CHEF-DRII-SYSTEM.47
4.23. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN.48
4.23.1. CACK-METHODE.48
4.23.2. ELEKTROKOMPETENTE
S. AUREUS-ZELLEN (SCHENK UND LADDAGA, 1992).49
4.24. TRANSFORMATION.49
4.24.1. CACK-KOMPETENTER E. COLI-ZELLEN.49
4.24.2. ELEKTROPORATION VON S. AUREUS (SCHENK UND LADDAGA, 1992).49
4.25. STATISTIK.50
5. ERGEBNISSE. 51
5.1. EPIDEMIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG ZUR BIOFIMBILDUNG
VON
S. EPIDERMIDIS UND S. AUREUS.51
5.1.1. VORKOMMEN DES ICA-GENLOKUS IN
S. EPIDERMIDIS UND S. AUREUS.52
5.1.2. BIOFILMBILDUNG IN
S. EPIDERMIDIS UND S. AUREUS.53
5.1.3. ZUSAMMENHANG ZWISCHEN DEM I'CA-GENLOKUS UND DER BIOFILMBILDUNG
IN
S. EPIDERMIDIS UND S. AUREUS.54
5.1.4. NACHWEIS DER INSERTIONSSEQUENZEN IS2J6 UND IS257.55
5.1.4.1. VORKOMMEN VON IS256.55
5.1.4.2. VORKOMMEN VON IS257.57
5.1.5. ANTIBIOTIKARESISTENZ DER
S. EPIDERMIDIS- UND S. AUREUS-ISOLATE.58
5.1.5.1. ANTIBIOTIKARESISTENZ DER
S. EPIDERMIDIS-ISOLATE.58
5.1.5.2. ANTIBIOTIKARESISTENZ DER S. AWREWS-ISOLATE.59
5.1.6. ZUSAMMENHANG ZWISCHEN GENTAMICIN-RESISTENZ
UND DEM NACHWEIS VON IS
256. 60
5.1.7. ZUSAMMENHANG ZWISCHEN BIOFILM UND ANTIBIOTIKARESISTENZ.61
5.2. INDUKTIONSTEST FUER DIE BIOFILMBILDUNG.64
5.2.1. EINFLUSS VON SYNERCID
YY
AUF DIE BIOFILMBILDUNG.65
5.2.2. EINFLUSS VON TETRAZYKLIN AUF DIE BIOFILMBILDUNG.66
III
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.3. EINFLUSS VON NACL AUF DIE BIOFILMBILDUNG.67
5.2.4. ZUSAMMENFASSENDER UEBERBLICK ZUR INDUKTION DER BIOFILMBILDUNG
DURCH ANTIBIOTIKA UND OSMOLARITAET.68
5.3. PHASENVARIATION DER BIOFILMBILDUNG IN EINEM
S. EPIDERMIDIS-HAMWEGSISOLAT.70
5.3.1. PCR-AMPLIFIKATION DER /CA-GENE
IN BIOFILM-NEGATIVEN S. EPIDERMIDIS-STAEMMEN.70
5.3.1.1. PCR-AMPLIFIKATION VON
ICAA.70
5.3.1.2. PCR-AMPLIFIKATION VON
ICAB.71
5.3.1.3. PCR-AMPLIFIKATION VON
ICAC.71
5.3.2. NUKLEOTIDSEGUENZIERUNG DES /CAC-PCR-PRODUKTES
AUS
S. EPIDERMIDIS 569.72
5.3.3. REVERSION DER BIOFILMBILDUNG IN
S. EPIDERMIDIS 569.73
5.3.4. PULSFELDGELELEKTROPHORESE (PFGE)-ANALYSE VON
S. EPIDERMIDIS 569
UND DEN REVERTANTEN, BIOFILM-POSITIVEN STAEMMEN.73
5.3.5. VERGLEICHENDE PCR-ANALYSE DES ICUC-GENS VON
S. EPIDERMIDIS 569
UND DEN REVERTANTEN STAEMMEN.74
5.3.6. BIOFILMBILDUNG UND ANTIBIOTIKARESISTENZ IN
S .EPIDERMIDIS 569
UND DEN REVERTANTEN STAEMMEN.75
5.3.7. HYBRIDISIERUNGSMUSTER VON
IS256 UND IS257 IM GENOM
VON
S. EPIDERMIDIS 569 UND DEN REVERTANTEN STAEMMEN.77
5.3.7.1. IS25OE- UND ICAC-HYBRIDISIERUNG.77
5.3.7.2. IS257-HYBRIDISIERUNG.78
5.4. VARIABILITAET DER BIOFILMBILDUNG IN
S. AUREUS.80
5.4.1. BIOFILMENTSTEHUNG BEI URSPRUENGLICH
NICHT-BIOFILMBILDENDEN
S. AT/REUS-STAEMMEN.80
5.4.2. API-STAPH-TEST, SLIDEX-STAPH-TEST UND BIOFILM-TEST
MIT
S. AUREUS 483 UND DEN VARIANTEN STAEMMEN.81
5.4.3. PFGE-ANALYSE VON
S. AUREUS 483 UND DEN VARIANTEN STAEMMEN.83
5.4.4. VERGLEICH DER ANTIBIOTIKARESISTENZEN VON
S. AUREUS 483
UND DEN VARIANTEN STAEMMEN.83
5.4.5. VERGLEICH DES GESAMTPROTEINENGEHALTES VON
S. AUREUS 483
UND DEN VARIANTEN STAEMMEN DURCH POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE.84
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5.4.6. VERGLEICH DER PIA-EXPRESSION VON
S. AUREUS 483
UND DEN VARIANTEN STAEMMEN DURCH IMMUNOBLOT.85
5.5. GENETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR VARIATION DER BIOFILMBILDUNG IN
S. AUREUS.87
5.5.1. SOUTHERN BLOT-ANALYSE VON
AGR-, SAR-, SIGB- UND /CA-OPERONS.87
5.5.1.1. SOUTHERN BLOT-ANALYSE DES /CA-OPERONS.88
5.5.1.2. SOUTHERN BLOT-ANALYSE DES AGR-SYSTEMS.88
5.5.1.3. SOUTHERN BLOT-ANALYSE DES SARA-GENS.88
5.5.1.4. SOUTHERN BLOT-ANALYSE DES S/GB-GENS.89
5.5.2. UNTERSUCHUNG ZUR TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET DES
AGR- UND S/GB-SYSTEMS
DURCH NORTHERN BLOT-ANALYSE.90
5.5.2.1. NORTHERN BLOT-ANALYSE DES AGR-SYSTEMS.90
5.5.2.2. NORTHERN BLOT-ANALYSE DES S/GB-SYSTEMS.91
5.5.3. SEQUENZANALYSE DES S/GB-SYSTEMS.91
5.5.3.1. SEQUENZANALYSE DES RS&U-GENS.92
5.5.3.2. SEQUENZANALYSE DES
RSBV-GENS.93
5.5.3.3. SEQUENZANALYSE DES
RSBW-GENS.94
5.5.3.4. SEQUENZANALYSE DES S/GB-GENS.95
5.5.4. KOMPLEMENTATION VON SIGB UND EFFEKT AUF DIE BIOFILMBILDUNG
IN SIGB-NEGATIVEN
S. AUREUS 483-VARIANTEN.96
5.5.4.1. VERGLEICH DER BIOFILMBILDUNG.97
5.5.4.2. PFGE-ANALYSE.97
5.5.4.3. SOUTHERN BLOT-ANALYSE MIT DEM S/GB-GEN.98
5.5.4.4. NORTHERN BLOT-ANALYSE MIT DEM AS/?23-GEN
UND SEQUENZIERUNG DES S/GB-OPERONS.99
6. DISKUSSION.101
NOSOKOMIALE STAPHYLOKOKKENINFEKTIONEN ALS GESUNDHEITSPROBLEM DER
GEGENWART.101
6.1. EPIDEMIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN.103
6.1.1. DAS
ICA-OPERON UND BIOFILMBILDUNG KOMMEN HAEUFIGER
BEI KLINISCHEN STAPHYLOKOKKENSTAEMMEN VOR
ALS BEI SAPROPHYTAEREN ISOLATEN.103
6.1.2. DIE BIOFILMBILDUNG DURCH DAS /CA-OPERON
WIRD VON UMWELTFAKTOREN BEEINFLUSST.104
V
INHALTSVERZEICHNIS
6.1.3. IS2.56 ALS MARKER FUER PATHOGENE STAPHYLOKOKKENSTAEMME.106
6.1.4. ANTIBIOTIKARESISTENZEN KOMMEN HAEUFIGER
BEI KLINISCHEN STAPHLOKOKKEN VOR.107
6.1.5. ASSOZIATION DER GENTAMICINRESISTENZ MIT IS2J6.108
6.1.6. ASSOZIATION ZWISCHEN ANTIBIOTIKARESISTENZ UND BIOFILMBILDUNG.108
6.2. VARIATIONEN DER BIOFILMBILDUNG IN STAPHYLOKOKKEN.109
6.2.1. DAS NATUERLICH VORKOMMENDE IS256-ELEMENT IST
IN VIVO AM AN- UND
AUSSCHALTEN DES /CA-OPERONS IN
S. EPIDERMIDIS BETEILIGT.110
6.2.2. PHASENVARIATION DER BIOFILMBILDUNG IN
S. AUREUS.111
6.2.2.1. DIE BIOFILMBILDUNG IN
S. AUREUS
UNTERLIEGT EINER STARKEN PHASENVARIATION.111
6.2.2.2. DER EINFLUSS VON SIGB AUF DIE BIOFILMBILDUNG IN
S. AUREUS 483.112
6.2.2.3. MOEGLICHE MECHANISMEN DER SIGB-EXPRESSION IN
S. AUREUS 483.114
7.
LITERATUR.117
8. ANHANG.132
8.1. STAMMSAMMLUNG.132
8.2. ABKUERZUNGEN.156
8.3. PUBLIKATIONEN UND TAGUNGSBEITRAEGE.158
8.4. LEBENSLAUF.159
VI |
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