Untersuchungen zur Funktion einer regulatorischen DNA-Sequenz im Bereich des IgLambda-Enhancers des Menschen:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
PROBLEMSTELLUNGEN
UND
ZIELSETZUNGEN
8
3
MATERIAL
UND
METHODEN
10
3.1
GERAETE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
10
3.2
REAGENZIEN
_
10
3.2.1
CHEMIKALIEN_
10
3.2.1.1
FEINCHEMIKALIEN
_
10
3.2.1.2
BIOCHEMIKALIEN_
11
3.2.1.2.1
MIKROBIOLOGIE
_
11
3.2.1.2.2
ZELLKULTUR
_
11
3.2.1.3
RADIOCHEMIKALIEN
_
11
3.2.2
ENZYME
_
11
3.2.3
KITS
_
11
3.2.4
OLIGONUKLEOTIDE
12
3.3
ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
_
12
3.3.1
MEDIEN,
PUFFER,
LOESUNGEN
_
12
3.3.2
KLONIERUNGEN
_
12
3.3.2.1
BAKTERIEN
UND
MEDIEN
12
3.3.2.2
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
_
13
3.3.2.3
TRANSFORMATION
_
13
3.3.2.4
PLASMIDREINIGUNG
ZU
PRAEPARATIVEN
ZWECKEN
_
13
3.3.2.5
PLASMIDREINIGUNG
ZU
ANALYTISCHEN
ZWECKEN
14
3.3.3
ANALYSE
UND
MANIPULATION
VON
NUKLEINSAEUREN
_
14
3.3.3.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN_
14
3.3.3.2
ELEKTROPHORESE
MIT
AGAROSEGELEN_
14
3.3.3.3
LAENGENSTANDARDS
_
15
3.3.3.4
FRAGMENTISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
_
16
3.3.3.5
LIGIERUNG
VON
DNA
_
_
16
3.3.3.6
DEPHOSPHORYLIERUNGEN/
LIGIERUNGSTEST
_
16
3.3.3.7
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
_
17
3.3.3.8
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
_
17
3.3.3.9
IN
VITRO
MUTAGENESE
MIT
EINEM
MEGAPRIMER
18
3.4
YYIN
VIVO
FOOTPRINTING
"
_
20
3.4.1
ZELLINIEN_
20
3.4.2
IN
VIVO
METHYLIERUNG
VON
DNA
MIT
DMS
UND
SPALTUNG
MIT
PIPERIDIN
_
21
3.4.2.1
ZELLINIEN-DNA
_
21
3.4.2.2
FREIE
DNA
_
22
3.4.3
LIGIERUNGSVERMITTELTE
PCR
(LMPCR)
_
23
3.4.3.1
STRANGAUFFILLLREAKTION
_
23
3.4.3.2
LIGIEREN
EINES
ADAPTERS
AN
DEN
DOPPELSTRANG
_
23
3.4.3.3
AMPLIFIZIERUNG
24
3.4.3.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
_
_
24
3.4.4
ANALYSE
MIT
HILFE
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
24
3.5
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
_
25
3.5.1
VEKTOREN
_
25
3.5.2
ZELIINIE
_
26
3.5.3
ELEKTROPORATION
_
26
3.5.4
ENZYMMESSUNGEN
_
27
3.5.4.1
ERNTE DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
_
27
3.5.4.2
FIREFLY
LUCIFERASE
UND
RENILLA
LUCIFERASE-BESTIMMUNG
27
3.6
BIOLOGISCHE
SICHERHEIT
28
4
ERGEBNISSE
29
4.1
IN
VIVO
FOOTPRINTS
_
29
4.1.1
VORUEBERLEGUNGEN
ZUR
LMPCR
METHODE
_
36
4.1.1.1
AUSWAHL
DER
DNA-POLYMERASEN
_
36
4.1.1.2
PCR-PARAMETER
_
38
4.1.2
VORVERSUCHE
ZUR
LMPCR
METHODE
_
39
4.1.2.1
BESTIMMUNG
DER
ANLAGERUNGSTEMPERATUREN
(T(M))
DER
OLIGONUKLEOTIDE
_
40
4.1.2.2
TEST
UND
OPTIMIERUNG
DER
LMPCR-BEDINGUNGEN
_
43
4.1.3
UNTERSUCHTER
BEREICH
_
44
4.1.4
ANALYSE
DER
HSS-1
REGION
MIT
DER
"IN
VIVO
FOOTPRINTING"-METHODE
_
44
4.1.4.1
IN
VIVO
FOOTPRINTS
IM
BEREICH
VON
HSS-1/1
_
51
4.1.4.2
IN
VIVO
FOOTPRINTS
IM
BEREICH
ZWISCHEN
HSS-1/1
UND
HSS-L/B
_
56
4.1.4.3
IN
VIVO
FOOTPRINTS IM
BEREICH
VON
HSS-L/B
_
59
4.1.4.4
IN
VIVO
FOOTPRINTS
IM
BEREICH
VON
HSS-1/2
_
65
4.1.4.5
VERGLEICH
DER
ERGEBNISSE
DES
YYIN
VIVO
FOOTPRINTINGS
"
MIT
DER
COMPUTERGESTUETZTEN
SEQUENZANALYSE
VON
HSS-1
_
66
4.1.4.6
ZUSAMMENFASSUNG
73
4.2
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
75
4.2.1
VERSUCHE
ZUR
FUNKTIONELLEN
CHARAKTERISIERUNG
VON
HSS-1
MIT
HILFE
TRANSIENTER
EXPRESSION.
_
77
4.2.2
DURCHFUEHRUNG
UND
AUSWERTUNG
DER
VERSUCHE
_
79
4.2.2.1
WAHL
DER
TRANSFEKTIONSMETHODE
_
79
4.2.2.2
WICHTIGE
PARAMETER
DER
ELEKTROPORATION
_
80
4.2.2.3
DIE
BEDEUTUNG
DER
DNA-PRAEPARATION
FUER
DIE
TRANSFEKTIONSEFIIZIENZ
_
81
4.2.2.4
DER
EINFLUSS
DER
DNA-MENGE
AUF
DIE
ELEKTROPORATION
_
81
4.2.2.5
AUSWERTUNG
DER
EXPRESSIONSDATEN
_
83
4.2.3
ERGEBNISSE
DER
TRANSIENTEN
TRANSFEKTION
_
84
4.2.3.1
DELETIONEN
DES
3'
BZW.
5'
BEREICHES
VON
HSS-1
_
84
4.2.3.1.1
HERSTELLUNG
DER
KONSTRUKTE
85
4.2.3.1.2
TEST
DER
KONSTRUKTE
IN
TRANSIENTEN
TRANSFEKTIONSVERSUCHEN
90
4.2.3.2
INTERNE
DELETIONEN
IN
HSS-1
_
93
4.2.3.2.1
HERSTELLUNG
DER
KONSTRUKTE
94
4.2.3.2.2
TEST
DER
KONSTRUKTE
IN
TRANSIENTEN
TRANSFEKTIONSVERSUCHEN
98
4.2.3.3
PUNKTMUTATION
EINZELNER
SEQUENZELEMENTE
VON
HSS-1
102
4.2.3.3.1
HERSTELLUNG
DER
KONSTRUKTE
105
4.2.3.3.2
TEST
DER
KONSTRUKTE
IN
TRANSIENTEN
TRANSFEKTIONSVERSUCHEN
109
4.2.3.4
KONSTRUKTE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DES
MOEGLICHEN
TOPOLOGISCHEN
EFFEKTES
DER
ANORDNUNG
DER
MODULE
HSS-1
UND
HSS-3
111
4.2.3.4.1
HERSTELLUNG
DER
KONSTRUKTE
UND
DEREN
TEST
IN
TRANSIENTEN
TRANSFEKTIONSVERSUCHEN
114
4.2.3.5
VERSUCHE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
DES
PROMOTORS
DES
GENS
DL
129
4.2.3.5.1
HERSTELLUNG
DER
KONSTRUKTE
130
4.2.3.5.2
TEST
DER
KONSTRUKTE
IN
TRANSIENTEN
TRANSFEKTIONSVERSUCHEN
130
5
DISKUSSION
132
5.1
DIE
FUNKTIONEN
VON
HSS-1
132
5.1.1
DIE
ROLLE
VON
HSS-1/1
UND
HSS-1/2
FUER
DIE
REGULATION
DES
GENS
DL
132
5.1.2
DIE
ROLLE
VON
HSS-L/B
BEI
DER
EXPRESSION
EINER
L-KETTE
VOM
X-TYP
_
133
5.1.3
DIE
BEDEUTUNG
VON
HSS-1
FUER
DIE
B-ZELLENTWICKLUNG
138
5.2
AUSBLICKE
_
141
5.2.1
UNTERSUCHUNGEN
AN
PRIMAERZELLEN
144
5.2.2
STABILE
TRANSFEKTIONSSTUDIEN
144
6
ZUSAMMENFASSUNG
145
7
LITERATURVERZEICHNIS
14
8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
153
ANHANG
LEBENSLAUF |
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