Untersuchungen zum Assimilat- und Wassertransfer in der Interaktion zwischen Arabidopsis thaliana und Heterodera schachtii:
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Autor: Jürgensen, Katja
Jahr: 2001
INHALTSVERZEICHNIS I
Abkürzungsverzeichnis V
1 Einleitung 1
2 Einführung in das Arbeitsgebiet 3
2.1 Lebenszyklen der Wurzelgallen- und Zystennematoden 3
2.2 Nährstoffversorgung des Nematoden 4
2.3 Transferprozesse zwischen Wirtspflanze und Nährzellensystem 6
2.4 Zuckertransportproteine 7
2.5 Wasserversorgung der Nährzellen 9
2.6 Biotechnologische Strategien der Nematodenbekämprung 11
3 Material und Methoden 14
3.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 14
3.2 Enzyme 18
3.3 Organismen 19
3.3.1 Bakterienstämme 19
3.3.2 Pflanzenmaterial 19
3.3.3 Anzucht der Pflanzen 20
3.4 Nematoden und Nematodenkultur 22
3.5 Nematodemnfektionstest 24
3.6 Histochemische GUS-Analyse 27
3.7 Lichtmikroskopische Untersuchungen 28
3.7.1 Lokalisation der GUS-Aktivität im Gewebe 28
3.7.1.1 Vibratomtechnik 28
3.7.1.2 Harzeinbettung 28
3.7.1.2.1 Präfixierung 28
3.7.1.2.2 Fixierung und Einbettung 28
3.7.2 Mikroskopsiche Detektion der GFP-Fluoreszenz 29
3.8 Molekularbiologische Untersuchungen 31
3.8.1 Isolierung von Nukleinsäuren 31
3.8.1.1 Isolierung genomischer DNA nach der CTAB-Methode 31
3.8.1.2 Isolierung genomischer DNA mit dem Quiagen*-Extraktionskit 32
n
INHALTSVERZEICHNIS
3.8.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA
3.8.1.4 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem Qiagen -Extraktionskit
3.8.1.5 Gewinnung von RNA aus Syncytien
3.8.1.5.1 Gewinnung von Zytoplasma aus Syncytien
3.8.1.5.2 Isolierung von RNA aus Syncytien-Zytoplasma
3.8.2 DNA-Agarose-Gelelektrophorese
3.8.3 Elution von DNA aus Agarosegelen
3.8.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
3.8.5 RT-PCR
3.8.6 Klonierungsmethoden
3.8.6.1 Klonierung verschiedener Konstrukte in den binären Vektor pMOG819
3.8.6.1.1 Klonierung der Promotoren ppyk2(Msp und All 164 in pMOG819
3.8.6.1.2 Klonierung der Antisensegene von SUC2 und PIP2a in pMOG819
3.8.7 Transformationsmethoden
3.8.7.1 Transformation von E. coli
3.8.7.1.1 Herstellung transformationskompetenter E. co/i-Zellen
3.8.7.1.2 Transformation und Selektion
3.8.7.2 Transformation der rekombinanten pMOG819 in A. tumefaciens
3.8.7.3 Transformation von A. thaliana mittels A. tumefaciens
3.8.7.3.1 Topflcultivierung der Transformanden
3.8.7.3.2 Transformanden-Screening
3.8.7.3.2.1 Untersuchung der Segregationsrate
3.8.7.3.2.2 PCR-Nachweis der SUC2- bzw. PIP2a-Antisensekonstukte
32
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33
33
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44
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49
49
4 Ergebnisse 51
4.1 Saccharose-und Hexose-Transporter 51
4.1.1 Saccharose- und Hexose-Transporter nach Infektion mit H. schachtü 51
4.1.1.1 Analyse der AtSUC2-Promoter-gus Pflanzen 52
4.1.1.2 Analyse der AtSUC2-Vramaü!t-gjp Pflanzen 53
4.1.1.3 Pfropfexperimente 55
4.1.1.4 Identifikation der roRNA von AtSUC2 in Wildtvp-Syncytien mittels 56
RT-PCR
4.1.1.5 PCR-Nachweis diverser Hexose- und Saccharose-Transporter in einer 58
syncytien-spezifischen cDNA-Bank
INHALTSVERZEICHNIS III
4.1.2 Saccharose- und Hexose-Transporter nach Infektion mit M. incognita 60
4.1.2.1 Analyse der AtSUC2-Promoter-gus Pflanzen 60
4.1.2.2 Analyse der AtSUC2-Promoter-g/p Pflanzen 62
4.1.3 SUC2-Antisense-Konstukte mit nematodenresponsiven Promotoren 68
4.1.3.1 Herstellung der ppyk20Msp-SUC2 und p^/// W-SUC2-Antisense- 68
Konstrukte
4.1.3.2 Transformation von A. thaliana und Segregationsanalyse der transgenen 72
Linien
4.1.3.3 PCR-Nachweis der klonierten Konstrukte in den transgenen Linien 72
4.1.4 Nematodeninfektionstests 74
4.1.4.1 Nematodeninfektionstests mit ff. schachtii 75
4.1.4.2 Nematodeninfektionstests mit M. incognita 79
4.2 Protonen-ATPase AtAHA3 83
4.2.1 Identifikation der mRNA von AtAHAi in Wildtyp-Syncytien mittels 83
RT-PCR
4.3 Aquaporine 84
4.3.1 Aquaporine nach Infektion mit H. schachtii 84
4.3.1.1 Analyse der AtPlP2a-Promoter-gus Pflanzen 85
4.3.1.2 Identifikation der mRNA von AtPIP2a in Wildtyp-Syncytien mittels 86
RT-PCR
4.3.2 Aquaporine nach Infektion mit M. incognita 87
4.3.2.1 Analyse der ,4 tf /P2a-Promotor-gus Pflanzen 88
4.3.3 PIP2a-Antisense-Konstukte mit nematodenresponsiven Promotoren 91
4.3.3.1 Herstellung der ppyk2OMsp-PTP2a. und pA// «-PIP2a-Antisense- 91
Konstrukte
4.3.3.2 Transformation von A. thaliana und Segregationsanalyse der transgenen 94
Linien
4.3.3.3 PCR-Nachweis der klonierten Konstrukte m den transgenen Linien 94
4.3.4 Nematodeninfektionstests 96
4.3.4.1 Nematodeninfektionstests mit H. schachtii 96
4.3.4.2 Nematodeninfektionstests mit M. incognita 101
S Diskussion 104
S.l Assimilattransfer in Nährzelknsysteme 104
IV INHALTSVERZEICHNIS
5.1.1 AtSUC2 im Nährzellensystem von H. schachtii 104
5.1.2 AtSUC2 im Nährzellensystem von M. incognita 112
5.2 Wasserversorgung der Nährzellensysteme 113
5.2.1 AtPIP2a in den Nährzellensystemen von H. schachtii und M. incognita 113
5.3 Einfluß der SUC2- und PIP2a-Antisense-Pflanzen auf H. schachtii und 116
M. incognita
Zusammenfassung 123
Summary 125
Literatur 127
Anhang 141
|
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