Molekularbiologische Untersuchungen zur Pathogenese des Morbus Hodgkin anhand der Zell-Linie L1236 und primärer Hodgkin-Reed-Sternbergzellen:
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2001
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6
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
9
1.1
DER
MORBUS
HODGKIN
.
9
1.2
DIE
HODGKIN/REED-STEMBERG-ZELLEN
.
9
1.2.1
H/RS-ZELLEN
SIND
KLONAL
.
10
1.2.2
H/RS-ZELLEN
STAMMEN
VON
KEIMZENTRUMS
B-ZELLEN
AB
.
11
1.2.3
DAS
TRANSFORMIERENDE
PRINZIP
DER
H/RS-ZELLEN
IST
UNBEKANNT
.
12
1.3
OFFENE
FRAGEN
ZUR
PATHOGENESE
DES
M.
HODGKIN
.
13
1.4
DIE
ZELL-LINIE
L1236
STELLT
EIN
MODELL
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
H/RS-ZELLEN
DAR
.
13
1.5
DIE
METHODE
DER
ALLELOTYPISIERUNG
.
14
1.6
ZIEL
DER
ARBEIT
.
15
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
16
2.1
FALLBERICHT
.
16
2.2
ZELL-LINIEN
UND
GEWEBESCHNITTE
.
18
2.3
ZELLKULTIVIERUNG
.
20
2.4
EXTRAKTION
VON
DNA
.
21
2.4.1
EXTRAKTION
HOCHMOLEKULARER
DNA
AUS
ZELLEN
.
21
2.4.2
DNA-EXTRAKTION
AUS
GEFRIERSCHNITTEN
.
23
2.4.3
DNA-EXTRAKTION
AUS
PARAFFINSCHNITTEN
.
23
2.5
EXTRAKTION
VON
RNA
.
24
2.5.1
RNA-EXTRAKTION
AUS
GROSSEN
ZELLMENGEN
.
24
2.5.2
RNA-EXTRAKTION
AUS
KLEINEN
ZELLMENGEN
.
25
2.5.3
ISOLIERUNG
VON
MRNA
.
26
2.5.4
SYNTHESE
VON
CDNA
.
26
2.6
NUKLEINSAEURETRANSFER
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
UND
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
SEQUENZEN
DURCH
HYBRIDISIERUNG
MARKIERTER
DNA
FRAGMENTE
AN
MEMBRAN
GEBUNDENE
DNA
.
27
2.6.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
NUKLEINSAEUREKONZENTRATION
.
27
7
2.6.2
AUFREINIGUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
DURCH
EIN
AGAROSE-GEL
.
27
2.6.3
INTERNE
MARKIERUNG
EINES
DNA
FRAGMENTES
FUER
SOUTHERN
ODER
NORTHERN
BLOT
.
28
2.6.4
SOUTHERN-BLOT
.
29
2.6.5
NORTHERN-BLOT
.
32
2.7
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
33
2.7.1
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
33
2.7.2
OLIGONUKTLEOTIDE
DIE
FUER
DIE PCR
VERWENDET
WURDEN
.
35
2.7.2.1
ZUR
ALLELOTYPISIERUNG
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
35
2.7.2.2
ZUR
AMPLIFIKATION
DER
VP[L
-GEN-UMLAGERUNG
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
38
2.7.2.3
ZUR
AMPLIFIKATION
DER
V
K
3-GEN-UMLAGERUNG
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
38
2.7.2.4
ZUR
AMPLIFIKATION
DES
P53-GENS
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
39
2.7.2.5
ZUR
AMPLIFIKATION
DES
SS-AKTIN-GENS
VERWENDTE
OLIGO
NUKLEOTIDE
.
39
2.7.2.6 TEMPERATUR-ZEIT-PROTOKOLLE
UND
KONZENTRATIONEN
DES
MGC 2
DER
VERSCHIEDENEN
POLYMERASE-KETTENREAKTIONEN
.
40
2.8
ANFAERBUNG
VON
DNA
IN
POLYACRYLAMID-GELEN
DURCH
SILBERIONEN
.
41
2.9
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
MIT
DER
DIDESOXY-METHODE
.
43
2.10
FAERBUNG
DER
IMMUNGLOBULINE
MIT
DER
APAAP-METHODE
.
44
3
ERGEBNISSE
.
46
3.1
VERGLEICH
DER
VNL-GEN-UMLAGERUNG
DER
L1236
ZELLEN
MIT
DER
PRIMAERER
H/RS
ZELLEN
DES
PATIENTEN
IM
VERLAUF
DER
ERKRANKUNG
.
46
3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
UND
TRANSKRIPTION
DER
UMGELAGERTEN
VJQL
UND
V
K
3-GENE
IN
L1236
UND
H/RS-ZELLEN
DES
PATIENTEN
.
49
3.2.1
UNTERSUCHUNG
DER
IG-GEN
EXPRESSION
DER
L1236
ZELLEN
.
49
3.2.2
UNTERSUCHUNG
DER
TRANSKRIPTION
DER
IG-GENE
IN
LI
236
UND
PRIMAEREN
H/RS-ZELLEN
.
51
3.3
UNTERSUCHUNG
DES
PROMOTORBEREICHES
DES
VNL-GENS
DER
L1236
UND
PRIMAEREN
H/RS-ZELLEN
.
56
8
3.4
UNTERSUCHUNG
DES
LEADER-INTRONS
DES
V
K
3-GENS
DER
L1236
UND
PRIMAEREN
H/RS-ZELLEN
.
57
3.5
UNTERSUCHUNG
DES
KLASSENWECHSELS
DER
IG-GENE
IN
L1236
ZELLEN
.
60
3.6
UNTERSUCHUNG
DES
UEBERGANG
DER
VDJ
AUF
DIE
C-REGION
IN
DER
ZELL-LINIE
L1236
.
62
3.7
ALLELOTYPISIERUNG
DER
L1236
ZELLEN
.
62
3.8
UNTERSUCHUNG
DES
P53
GENS
DER
L1236
ZELLEN
.
66
3.9
ALLELOTYPISIERUNG
DER
ZELL-LINIE
BL60
.
66
4
DISKUSSION
.
70
4.1
EIN
H/RS-ZELLKLON
PERSISTIERT
UEBER
2
1/2
JAHRE
.
70
4.2
DIE
UMGELAGERTEN
VNL-UND
V
K
3-GENE
WERDEN
NUR
IN
SEHR
GERINGEN
MENGEN
IN
L1236
UND
PRIMAEREN
H/RS-ZELLEN
TRANSKRIBIERT
.
72
4.3
EINE
MUTATION
LIEGT
IM
BEREICH
DES
KONSERVIERTEN
OKTAMERS
DES
V
H
I
-GEN
PROMOTORS
.
73
4.4
MUTATIONEN
IM
LEADER-INTRON
DES
V^-GENS
FUEHREN
ZU
VERAENDERTEM
SPLEISSEN
.
75
4.5
L1236
ZELLEN
HABEN
EINEN KLASSENWECHSEL
HIN
ZU
IGG4
DURCHGEFUEHRT
UND
DAS
CY4-GEN
WIRD
KORREKT
AN
DIE
VDJ-REGION
GESPLEISST
.
76
4.6
ALLELOTYPISIERUNG
DER
L1236
ZELLEN:
ALLEIVERLUST
AUF
3
CHROMOSOMEN
.
77
4.7
ALLELOTYPISIERUNG
DER
ZELL-LINIE
BL60
.
79
4.8
EINORDNUNG
DER
ZELL-LINIE
L1236
IN
EIN
SZENARIO
DER
PATHOGENESE
DES
M.
HODGKIN
.
81
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
85
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
86
7
VORABVEROEFFENTLICHUNGEN
.
101
8
ANHANG
.
102
8.1
SEQUENZ
DER
VNL-GEN-UMLAGERUNG
DER
ZELL-LINIE
L1236
.
103
8.2
SEQUENZ
DER
V
K
3-GEN-UMLAGERUNG
DER
ZELL-LINIE
L1236
.
105
8.3
TABELLARISCHE
DARSTELLUNG
DER
ERGEBNISSE
DER
ALLELOTYPISIERUNG
.
107 |
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