Isolierung von pathogenetisch spezifischen Gensequenzen aus synovialen Fibroblasten von Patienten mit rheumatoider Arthritis:
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Regensburg
2001
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_
INHALTSVERZEICHNIS
A
TH
T
_
T
-
TTTTF
.
TR
,
F
YY,
IRTTTTT
,
1
2.
^^ATE^
HAT
12
YY
1.1.
DAS
MENSCHLICHE
GELENK
2
1.1.1.
GELENKKNORPEL.
.
2
1.1.2.
AUFBAU
DES
SYNOVIUMS
.
2
1.1.3.
ZELLEN
DER
SYNOVIALEN
DECKZELLSCHICHT
.
3
YY
1.2.
RHEUMATOIDE
ARTHRITIS
4
1.2.1.
SOZIALE
FOLGEN
.
5
1.2.2.
PRAEVALENZ
.
5
1.2.3.
HYPOTHESEN
ZUR
ENTSTEHUNG
DER
RA
.
6
YY
1.3.
ZIELSETZUNG
10
YY
2.1.
VERWENDETE
CHEMIKALIEN
12
YY
2.2.
VERWENDETE
PCR-PRIMER
14
YY
2.3.
NAEHRMEDIEN
UND
PLATTEN:
16
YY
2.4.
VERWENDETE
LOESUNGEN:
17
2.4.1.
LOESUNGEN
FIIR
DIE
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG.
17
2.4.2.
LOESUNGEN
FIIR
DIE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
(DNA-AUFTRENNUNG):
.
18
2.4.3.
LOESUNGENFIIR
DIE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE):
.
18
2.4.4.
LOESUNG
FIIR
SINGLE
STRAND
CONFORMATION
POLYMORPHISM
(SSCP)
GELE:
.
19
YY
2.5.
VERWENDETE
KITS
19
YY
2.6.
GERAETE
20
3.
METHODEN.
H
.YY.
H
,.H.YY.
M
.YY.YY.,
M
.YY.YYYY
M
.YY.YY.
M
.YY.YY.
M
.
M
.H.H.^.-.H.21
YY
3.1
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
21
3.1.1.
ASSERVATION
DES
GEWEBES
.
21
3.1.2.
EINFRIEREN
DES
GEWEBES
.
21
3.1.3.
GEWINNUNG
DER
ZELLEN
AUS
DEM
SYNOVIALGEWEBE
.
21
3.1.4.
ZELLKULTUR
.
21
3.1.5.
EINFRIEREN
/AUFTAUEN
DER
ZELLEN
.
22
3.1.6.
KONTROLLEN.
22
3.1.7.
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
22
3.1.8.
IMMUNHISTOCHEMIE
.
24
3.1.9.
CHEMOTAXIS
.
26
3.1.10.
ELISA.
28
3.1.11.
MAUS-OP.
.
30
YY
3.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
31
_
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1.
RNA-ISOLIERUNG
.
31
3.2.2.
RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
32
3.2.3.
RAP-PCR
.
32
3.2.4.
REVERSE
TRANSKRIPTION
FUER
RAP-PCR
.
33
3.2.5.
DURCHFUEHRUNG
DER
RAP-PCR
(RNA
ARBITRARILY
PRIMEDPOLYMERASE
CHAIN
REACTION)
.33
3.2.6.
HERSTELLUNG
DES
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
GROESSENSTANDARDS
.
35
3.2.7.
PAA-GELELEKTROPHORESE
.
36
3.2.8.
BANDENVERGLEICH
UND
AUSSCHNEIDEN
.
37
3.2.9.
ELUATION
UNDREAMPLIFIKATION
.
37
3.2.10.
SSCP
(SINGLE
STRANDCONFORMATIONPOFYMORPHISM)
-GEL.
.
38
3.2.11.
ELUATION
UND
REAMPLIFIKATION
AUS
DEM
SSCP-GEL,
WEITERE
AUFREINIGUNG
.
38
3.2.12.
KLONIERUNG
DER
ERHALTENEN
FRAGMENTE
.
39
3.2.13.
SELEKTION
POSITIVER
KOLONIEN
.
40
3.2.14.
ANLEGEN
VON
GLYZERINKULTUREN
ZUR
DAUERHAFTEN
AUFBEWAHRUNG
.
41
3.2.15.
KONTROLLE
DER
INSERTLAENGE MITTELS
PCR
.
41
3.2.16.
SEQUENZIERUNG
UND
DATENBANKSUCHE
.41
3.2.17.
PRIMERDESIGN
UND
-HERSTELLUNG
.
42
3.2.18.
BESTAETIGUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
EXPRESSION
MIT
SEMIQUANTITATIVER
RT-PCR
.
42
3.2.19.
REVERSE
TRANSKRIPTION
FILR
QUANTUMRNA'
"
.
43
3.2.20.
UEBERPRUEFUNG
DER
QUALITAET
DER
CDNA
.
43
3.2.21.
QUANTUMSSM
"
-PCR
.
44
3.2.22.
ELEKTROPHORESE
AUFNOVEX^-MINIGELEN
.
44
3.2.23.
PHOSPHORIMAGING.
.
44
3.2.24.
HERSTELLUNG
DER
SONDEN
FUER
DIE
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
45
3.2.25.
REALTIME
PCR
MIT
DEM
LIGHTCYCLER
.
46
3.2.26.
REALTIME
PCR
MIT
DEM
TAQMAN
.
50
3.2.27.
STEROIDSTIMULIERUNG
SYNOVIALER
FIBROBLASTEN
.
51
3.2.28.
MOMENT.
.
52
3.2.29.
RNA-ISOLIERUNG
AUS
LASERPROBEN
.
53
3.2.30.
RAP-PCR
AUS
MOMENT-PROBEN
.
53
3.2.31.
AUFREINIGUNG
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTER
SEQUENZEN
.
53
3.3.
RAP-PCR-MIKROARRAYS
54
3.3.1.
HERSTELLUNG
DER
RAP-PCRS
.
54
3.3.2.
HERSTELLUNG
DER
SONDEN
.
56
3.3.3.
HYBRIDISIERUNG
.
57
3.3.4.
HERSTELLUNG
DER
RNA-SONDEN
.
58
3.4.
P53-MUTATIONSANALYSEN
60
3.4.1.
DNA-ISOLIERUNG
.
60
3.4.2.
SSCP-GELELEKTROPHORESE
.
60
3.4.3.
NIRCA
(NONISOTOPIC
RNASE
CLEAVAGE
ASSQY)
.
60
3.4.4.
BESST-SCAN
.
62
II
_
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.5.
DIREKTSEQUENZIERUNG
.63
4.
ERGEBNISSE
.
64
YY
4.1.
ZELLKULTUR
64
YY
4.2.
RAP-PCR
64
4.2.1.
ETABLIERUNG
DER
RAP-PCR
.
64
4.2.2.
SSCP
.
65
4.2.3.
VERGLEICH
DER
SEQUENZDATEN
MIT
DER
GENBANK
.
66
YY
4.3.
KANDIDATENGENE
67
YY
4.4.
CENP-E
67
4.4.1.
BESTAETIGUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
EXPRESSION
MIT
SEMIQUANTITATIVER
RT-PCR
.
67
4.4.2.
AUSWERTUNG
DER
YYQUANTUMRNAYYSEMIQUANTITATIVE
RT-PCR"
MIT
DEM
PHOSPHOR-IMAGER
.
68
4.4.3.
UEBERPRUEFUNG
DER
EXPRESSION
VON
CENP-E
MIT
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
.
69
4.4.4.
IMMURIHISTOCHEMISCHER
NACHWEIS
.
70
4.4.5.
FUNKTIONELLE
UNTERSUCHUNGEN
.
70
4.4.6.
KLONIERUNG
DER
GESAMTEN
CENP-E-CDNA
.
71
YY
4.5.
TAKLC,
HAUSP,
CYCLIN
B
UND
NF-Y
71
YY
4.6.
SDF-1
72
4.6.1.
SEMIQUANITATIVE
RT-PCR
.
72
4.6.2.
KORRELATION
MIT
DEN
PATIENTENDATEN
.
73
4.6.3.
SDF1-ELISA
.76
4.6.4.
SCID-MAUS-VERSUCHE
.
77
4.6.5.
IMMUNHISTOCHEMIE
.
77
4.6.6.
IN-SITU
HYBRIDISIERUNG
.78
4.6.7.
CHEMOTAXIS
.78
YY
4.7.
MOMENT
79
YY
4.8.
RAP-PCR-MIKROANAYS
81
4.8.1.
HERSTELLUNG
DER
ARRAYS
.
81
YY
4.9.
P53-MUTATIONSANALYSEN
84
4.9.1.
SSCP
.
84
4.9.2.
N1RCA
.
85
4.9.3.
BESST-SCAN
.
86
4.9.4.
DIREKTSEQUENZIERUNG
.
87
YY
5.1.
RAP-PCR
88
YY
5.2.
CENP-E
89
YY
5.3.
SDF1
90
III
_
INHALTSVERZEICHNIS
5.4.
LASERMIKRODISSEKTION
UND
RAP-PCR
94
5.5.
RAP-PCR-MIKROARRAYS
95
5.6.
P53-MUTATIONSANALYSEN
96
6
ZUSAMMENFASSUNG
99
7
LITERATURVERZEICHNIS
_
.FEHLER!
TEXTMARKE
NICHT
DEFINIERT.
8
118 |
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