Die CD44-Expression bei gynäkologischen Karzinomen: Ansatzpunkt für molekulare Diagnostik und Therapie
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3
SEITE
I INHALTSVERZEICHNIS 03
1 EINLEITUNG 09
1.1 EPIDEMIOLOGIE DES MAMMAKARZINOMS UND ZERVIXKARZINOMS 09
1.2
DER VIELSCHRITT-PROZESS DER METASTASIERUNG ALS HAEUFIG
LEBENSLIMITIERENDER FAKTOR 10
1.3 CD44
IN DER ONKOLOGISCHEN DIAGNOSTIK
11
1.3.1 EINFUEHRUNG 11
1.3.2 HUMANE CD44-EXPRESSION: PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN
13
1.3.3 HUMANE CD44-EXPRESSION IN MALIGNOMEN UND
KORRESPONDIERENDEN NORMALGEWEBEN 15
1.4 TUMORZELL-EPITOPE ALS ZIEL GENTECHNOLOGISCH
MODIFIZIERTER T-ZELLEN
19
1.4.1 DIE TUMORANERGIE DES ZELLULAEREN IMMUNSYSTEMS 19
1.4.2 ANTIGENERKENNUNG VON T-ZELLEN UND T-ZELL-REZEPTOR (TCR) 21
1.4.3 TCR-STIMULIERUNG, SIGNALTRANSDUKTION UND ZIELZEUYSE 22
1.4.4 FUNKTION UND AUFBAU VON SINGLE-CHAM ANTIKOERPERN (SCFV) 23
1.4.5 PRINZIP REKOMBINANTER T-ZELLEN (RCTL) 24
1.4.6 PROOF OF PRINCIPLE: RCTL MIT EXOGEN MODIFIZIERTER ANTIGEN-
SPEZIFITAET LYSIEREN ANTIGEN-EXPRIMIERENDE TUMORZELLEN 25
2 FRAGESTELLUNGEN 26
3 MATERIAL UND METHODEN
27
3.1 NACHWEIS DER CD44-EXPRESSION 27
3.1.1 IMMUNHISTOCHEMIE 27
3.1.2 GEWEBEDISMEMBRANATION UND GESAMT-RNA-EXTRAKTION 28
3.1.3 CDNA-SYNTHESE 28
3.1.4 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION 29
3.1.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 32
3.1.6 ALKALISCHER SOUTHERN BLOT 32
3.1.7 NICHT-RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNG 33
3.1.8 ZELLKULTUREXPERIMENTE 38
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4
3.1.8.1 KULTIVIEREN UND PASSAGIEREN EUKARYONTISCHER ZELLEN 38
3.1.8.2 KRYOKONSERVIERUNG EUKARYONTISCHER ZELLEN 38
3.1.8.3 ERNTEN EUKARYONTISCHER ZELLEN MIT EDTA ODER TRIZOL 38
3.2
GENTHERAPIEANSATZ MIT REKOMBINANTEN T-ZELLEN
39
3.2.1 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 39
3.2.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 39
3.2.3 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 39
3.2.4 LIGATION VON DNA 39
3.2.5 PRAEPARATION KOMPETENTER BAKTERIEN 40
3.2.6 TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN MIT PLASMID-DNA 40
3.2.7 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 40
3.2.8 KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN 41
3.2.9 ENZYMATISCHE SEQUENZIERUNG VON DNA 41
3.2.10 ANALYSE VON DNA IN DENATURIERENDEN POLYACRYLAMIDGELEN 41
3.2.11 IN VITRO-TRANSKRIPTION/-TRANSLATION 42
3.2.12 FLUOROGRAPHIE
42
3.2.13 CA-PHOSPHAT-TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN 42
3.2.14 ERNTEN RETRO VIRALER ZELLKULTURUEBERSTAENDE UND
INFEKTION VON EUKARYONTISCHEN ZELLEN 43
3.2.15 RETROVIRALER GENTRANSFER IN ZYTOTOXISCHE T-ZELLEN 43
3.2.16 BESTIMMUNG DES RETRO VIRALEN TITERS IN ZELLKULTURUEBERSTAENDEN
VON VERPACKUNGSZELLINIEN 44
3.2.17 IMMUNPRAEZIPITATION
44
3.2.18 BIOTINYLIERUNG VON ZELLOBERFLAECHENPROTEINEN
45
3.2.19 IMMUNOBLOT-ANALYSE VON PROTEINEN
45
3.2.20 MESSUNG DER IN VITRO-ZYTOTOXIZITAET VON T-ZELLEN 45
3.2.21 TIERVERSUCHE
46
3.2.21.1 INOKULATION DER TUMORZELLEN
46
3.2.21.2 INTRAVENOESE GENTHERAPIE MIT REKOMBINANTEN T-ZELLEN 46
3.2.22 STATISTISCHE AUSWERTUNG
47
5
4 ERGEBNISSE
47
4.1 DIAGNOSTIK: MAMMA-KARZINOM
4.1.1 UNTERSUCHUNG DER HUMANEN CD44-EXPRESSION BEIM MAMMA-
KARZINOM SOWIE KORRESPONDIERENDEM NORMALGEWEBE 47
4.1.2 UNTERSUCHUNGEN MOEGLICHER VERAENDERUNGEN DER CD44-
EXPRESSION IM VERLAUF DER KARZINOGENESE 53
4.1.3 DIE PROGNOSTISCHE BEDEUTUNG DER EXPRESSION BESTIMMTER
CD44-ANTIGENE BEIM MAMMA-KARZINOM 54
4.1.3.1 EXPRESSIONSHAEUFIGKEIT AM GROSSEN KOLLEKTIV 54
4.1.3.2 CD44V-EXPRESSION UND REZIDIVFREIES
(RFS) BZW. GESAMTUEBERLEBEN (OAS) 57
4.2 DIAGNOSTIK: ZERVIX-KARZINOM 60
4.2.1 UNTERSUCHUNGEN DER CD44-EXPRESSION BEIM ZERVIX-KARZINOM
SOWIE KORRESPONDIERENDEM NORMALGEWEBE 60
4.2.2 UNTERSUCHUNGEN MOEGLICHER VERAENDERUNGEN DER CD44-EX-
PRESSION IM VERLAUF DER ZERVIX-KARZINOGENESE 64
4.2.3 VERGLEICH DER CD44-EXPRESSION MIT DEM RISIKOFAKTOR
YYHOCHRISIKO-HPV-INFEKTION" 66
4.3 THERAPIE: MAMMA- UND ZERVIX-KARZINOM 70
4.3.1 KLONIERUNG DER CDNAS FUER DIE VARIABLEN REGIONEN DER
MAKS 1.1ASML (ANTI-CD44V6 (RATTE)), VFF7 (ANTI-
CD44V6 (MENSCH)) UND VFF17 (ANTI-CD44V7/8 (MENSCH)) 70
4.3.2 KLONIERUNG DER JEWEILIGEN CHIMAEREN SCFV--REZEPTORGENE 71
4.3.3 TRANSDUKTION ZYTOTOXISCHER T-ZELLEN MIT DEM JEWEILIGEN
CHIMAEREN REZEPTORGEN 74
4.3.4 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER REKOMBINANTEN CTL 74
4.3.5 UNTERSUCHUNG DER RCTL AUF IHRE CD44V-ANTIGEN
SPEZIFISCHE ZYTOTOXIZITAET IN VITRO 76
4.3.6 ADOPTIVER IMMUNTRANSFER VON CD44V6~SPEZIFISCHEN RCTL
BEI NACKTMAEUSEN MIT CD44V6-EXPRIMIERENDEN TUMOREN 78
DISKUSSION
DIAGNOSTIK: MAMMA-KARZINOM
DIAGNOSTIK: ZERVIX-KARZINOM
THERAPIE: MAMMA- UND ZERVIX-KARZINOM
ZUSAMMENFASSUNG
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