Entwicklung eines kompetitiven PCR-Assays für humane Oxytocin-, Oxytocin-Rezeptor-Genom-Transkripte zum Studium der Regulation des Oxytocin-, Oxytocin-Rezeptor-Gens in Zellkulturexperimenten:
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1. EINLEITUNG.1
1.1 DAS OXYTOCIN-, OXYTOCIN-REZEPTOR-SYSTEM.1
1.2. KLASSISCHE FUNKTIONEN DES OXYTOCIN-, OXYTOCIN-REZEPTOR-SYSTEMS.2
1.3. AUTOKRINE, PARAKRINE FUNKTIONEN IM BEREICH REPRODUKTIVER GEWEBE .3
1.4. VORKOMMEN VON OXYTOCIN-REZEPTOREN IN NICHT REPRODUKTIVEN GEWEBEN .4
1.5. AUTOKRINE, PARAKRINE REGULATION BEI HUMANEN KARZINOMEN.5
1.6.0XYTOCIN-AGO-, ANTAGONISTEN: NUTZEN, VERWENDUNG UND ZUKUENFTIGE
BEDEUTUNG.6
1.7.INTERESSE AN, BEDEUTUNG DES VERSTAENDNISSES DER REGULATION DES
OXYTOCIN-, OXYTOCIN-
REZEPTOR-SYSTEMS IM GEWEBE.7
1.8.NOTWENDIGKEIT DER ENTWICKLUNG EINER GEEIGNETEN METHODIK UM DIE
FEINHEITEN DER
REGULATION PRAEZISE ERFASSEN ZU KOENNEN.8
2. MATERIAL UND METHODEN.
V.10
2.1 .BAKTERIENSTAMM UND KULTUR.10
2.1.1 .BAKTERIENSTAMM.10
2.1.2. MEDIUM UND KULTUR.10
2.2.DNA-ANALYSE UND DNA-KLONIERUNG.11
2.2.1 .VERWENDETER VEKTOR.11
2.2.2. PLASMID-DNA-ISOLIERUNG AUS BAKTERIEN.11
2.2.3. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.13
2.2.4. FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN.14
2.2.5. RESTRIKTIONSSPALTUNGEN.14
2.2.6. AGAROSEGELELEKTROPHORESE.15
2.2.6.1. POSTELEKTROPHORETISCHE FAERBUNG VON AGAROSE- ODER
POLYACRYLAMIDGELEN MIT YYSYBR
GREEN".17
2.2.7.ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN./.17
2.2.8. LIGATION.18
2.2.8.1. DEPHOSPHORYLIERUNG VON RESTRINGIERTER VEKTOR-DNA.19
2.2.8.2. AUFFULLEN UEBERHAENGENDER ENDEN MIT DEM YYKLENOW-FRAGMENT" DER
DNA-
POLYMERASEL.20
2.2.8.3. VERSEHEN VON 5-ENDEN MIT REAKTIVEN PHOSPHATEN.20
2.2.9. TRANSFORMATION.22
2.2.10. VERWENDETE KLONIERUNGSSTRATEGIE ZUR ERSTELLUNG DER KOMPETITOREN
FUER DIE
KOMPETITIVE PCR.23
2.2.11. SEQUENZIERUNG.25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/963167197
INHALTSVERZEICHNIS N
2.3. PCR.28
2.4. ZELLKULTUR.30
2.4.1 .AUFTAUEN VON ZELLEN AUS DEM GEFRIERSCHRANK.31
2.4.2. PASSAGE DER ZELLEN.32
2.4.3. EINFRIEREN DER ZELLEN.32
2.4.4. ERMITTLUNG DER ZELLKONZENTRATION.32
2.4.5.STIMULATION DER ZELLEN.33
2.5. RNA-ANALYSE.33
2.5.1. GESAMT-RNA-PRAEPARATION AUS DEN ZELLKULTUREN.33
2.5.2. RNA-FORMALDEHYDGEL.34
2.5.3. CDNA-SYNTHESE.35
2.6.IN VITRO TRANSKRIPTION.37
2.6.1. VORBEREITUNG DES REKOMBINANTEN PLASMIDS.37
2.6.2.IN VITRO TRANSKRIPTION.37
3. ERGEBNISSE.39
3.1.OPTIMIERUNG DER CDNA-SYNTHESE.39
3.2,OPTIMIERUNG DER PCR-ANALYSE.41
3.2.1.INHALT DES PCR-ANSATZES.41
3.2.2. TEMPERATUR-ZYKLUS-BEDINGUNGEN.44
3.2.3 .PRODUKTDETEKTION.46
3.2.4.SCHLUSSFOLGERUNGEN UEBER DIE OPTIMALEN BEDINGUNGEN FUER DAS SYSTEM.48
3.2.5. UEBERLEGUNGEN ZUR KINETILC DER PCR.49
3.2.6. DIE KOMPETITIVE PCR ZUR QUANTIFIZIERUNG DER FRAGMENTE.52
3.2.7. KONTROLL-PCR FUER GAPDH.57
3.3 .RNA-BESTIMMUNGEN.59
/
/'
3.3.1.HUMANE GEWEBEPROBEN ZUR VALIDIERUNG DES SYSTEMS.59
3.3.2.SCREENING VON ZELLINIEN HUMANER REPRODUKTIVER GEWEBE.62
3.3.3.STIMULATION VON DU-145 ZELLEN MIT UNTERSCHIEDLICHEN EFFEKTOREN.66
4. DISKUSSION.69
4.1. METHODENKRITIK DES ETABLIERTEN KOMPETITIVEN PCR-SYSTEMS.69
4.2. EXISTENZ EINES LOKALEN AUTO-/PARAKRINEN OT-/OTR-SYSTEMS IN HUMANEN
CORPORA LUTEA.70
4.3. BESTIMMUNG DER HAEUFIGKEIT VON OT-/OTR-MRNA IN VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN UNTER
BASALEN BEDINGUNGEN.71
4.4. PROTEIN VERSUS MRNA REGULATION AUF TRANSLATIONSEBENE?.72
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.5 EINFLUSS VERSCHIEDENER EFFEKTOREN AUF DIE OTR-MRNA-EXPRESSION IN
DU-145-ZELLEN.72
4.6. MOEGLICHE THERAPIE-OPTIONEN FUER DIE BEHANDLUNG DER BENIGNEN
PROSTATA-HYPERPLASIE.74
4.7. BEDEUTUNG DES VERSTAENDNISSES DER REGULATION DES OT-/OTR-SYSTEMS FUER
DIE THERAPIE
HUMANER KARZINOME.75
4.8. AUSBLICKE FUER DIE ZUKUNFT.76
5 ZUSAMMENFASSUNG.77
6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.79
7 LITERATURVERZEICHNIS.
81
8 FIRMENVERZEICHNIS.
88
9 ERKLAERUNG.
.89
10 DANKSAGUNG.
90
11 LEBENSLAUF.
9* |
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