Isolierung und molekularbiologische Charakterisierung von Cytochrom bL und Saip, zweier Apoptose-induzierter Gene:
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München
Diss.-Verl. NG-Kopierladen
2002
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 4
1.1 DieNekrose 4
1.2 DieApoptose. 5
1.3 Apoptose Induktion g
1.3.1 Die Fas und TNF Rezeptorfamilie als Beispiel für die „ extrinsische
Apoptose Induktion , 8
1.3.2 Die Rollt der Mitochondrien und des Endoplasmatischen Retikulums bei der
„intrinsischen Apoptose Induktion 10
1.3.3 Die Caspasen 16
1.4 APOPTOSE INHIBITOREN 19
/ 4.1 Inhibitoren der Caspasen 19
1.4.2 Die Bcl 2 Familie 20
l .5 Ziele der arbeit 22
2 MATERIALIEN 23
2.1 CHEMIKALIEN 23
2.2 OLIGONUKLEOTIDE 25
2.3 Enzyme und „Kits 26
2.3.1 Restriktionsenzyme 26
2.3.2 Weitere Enzyme 26
2.3.3 „Kits . , 26
2.4 dna längenstandards 26
2.5 antikörper 27
2.6 proteinase inhibitorbn 27
2.7 Plasmide 27
2.8 Puffer und sonstiges .* 28
2.8.1 Puffer für die Gelelektrophorese 28
2.8.2 Weitere Puffer. 29
2.8.3 Sonstiges 30
3 METHODEN 31
3.1 Methoden der prokaryontischen Zellkultur 31
3.1.1 Prokaryontische Zellkulturbedingungen 31
3.1.2 Lagerung von Zellen. 31
3.1.3 Bakterienstämme 31
3.1.4 Herstellung kompetenter Bakterienzellen. , 32
3.1.5 Transformation von Bakterienzellen. 33
3.2 METHODEN DER EUKARYONTISCHEN ZELLKULTUR 34
3.2.1 Eukaryotische Zellkulturbedingungen 34
3.2.2 Lagerung von Zellen. 35
3.3 METHODEN DER ZELLKULTUR FÜR HEFEN 36
3.3.1 Zellkulturbedingungen 36
3.3.2 Lagerung der ZeUen 38
3.3.3 Transformation im kleinen Maßstab. •• 38
3.3.4 Transformation im großen Maßstab ~ 39
1
Inhaltsverzeichnis
3.3.5 ß GalAssay 41
3.3.6 Hefeminipreps ¦*/
3.4 DNA ARBEITSMETHODEN 42
3.4.1 Isolierung von Plasmid DNA 42
3.4.2 Präzipitation von Nukleinsäuren 44
3.4.3 Extraktion von Nukleinsäuren durch Phenol und Chloroform. 45
3.4.4 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA 46
3.4.5 Dephosphorylierung von DNA Fragmenten 46
3.4.6 Ugation von DNA Fragmenten 47
3.4.7 Transfektion eukaryotischer Teilen 47
3.4.8 Synthetische Oligodesoxyribonukleotide. 48
3.4.9 Spektrometrische Bestimmung von Nukleinsäure Konzentration und Reinheit 48
3.4.10 Agarose Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 48
3.4.11 Präparative Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarose Celen 49
3.4.12 Reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktum (RT PCR) 49
3.5 apoptose Tests 51
3.5.1 DNA Leiter 5/
3.5.2 Nachweis hypodiploider DNA 52
3.6 Cytotoxizitätstest durch LDH Freisetzunc 53
3.7 Spektrophotometrische Bestimmung der Aktivität von Komplex II
der Atmungskette 54
3.7.1 Isolierung der Mitochondrienför die Bestimmung der Aktivität von Komplex II 54
3.7.2 Aktivitätsbestimmung von Komplex 11 55
3.8 Proteinchemische Methoden 57
5.8.1 Bestimmung der Proteinkonzentration 57
3.8.2 Coomassie Färbung 58
3.8.3 Western Blol 59
3.8.4 ECL Detektion von Proteinen. 59
3.8.5 Ponceau S Fürbung von Proteinen 60
3.8.6 Expression und Aufreinigung von GST Fusionsproteinen 60
3.8.7 Herstellung einespolyklonalenAntiserums 61
3.8.8 Immunfluoreszenz 62
4 ERGEBNISSE 64
4.1 screening nach dominanten apoptose induzierenden genen 64
4.2 Einige der Apoptose induzierenden Genprodukte sind in den Mitochondrien
lokalisiert 65
4.3 Die Effizienz der apoptose Induktion durch CybL kann durch rationale
mutagenese optimiert werden 69
4.4 Die Transfektion von CybL fuhrt zu einer transienten Inhibition der
Aktivität von Komplex n 71
4.5 VERGLEICH DER APOPTOSE INDUKTION VON CYBL UND 3 NITROPROPIONSÄURE (3 NP) 74
4.6 CYBL DEFIZIENTE ZELLEN SIND RESISTENT GEGENÜBER
CYTOSTATIKA INDUZIERTERAPOPTOSE 77
4.7 Saip, ein Apoptose Inducer des Endoplasmatischen Retikulums 79
2
__ Inhaltsverzeichnis
4.7.1 Isolation eines weiteren Apoptose induzierenden Gens mit Homologie zu Genen aus
Celegans 79
4.7.2 Nur eines der Saip homologen Gene aus C. elegans induziert Apoptose «5
4.7.3 Sowohl der N Terminus als auch der C Terminus von Saip ist für die
Apoptose Induktion essentiell 87
4.7.4 Endogenes Saip ist im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert 90
4.8 BAP31 KANN SAIP INDUZIERTE APOPTOSE DEPRIMIEREN 95
4.9 SGT ist ein Interaktionspartner von Saip im „Yeast two Hybrid Assay 97
4.10 Saip und SGT interagierenfunktionell 100
5 DISKUSSION 102
5.1 SCREENING NACH DOMINANTEN, APOPTOSE INDUZIERENDEN GENEN 102
5.2 ERGEBNISSE DES SCREENINGS 105
5.3 KOMPLEX H DER ATMUNGSKETTE IST EIN SENSOR FÜR APOPTOSEINDUICTION 109
5.5. / Oberexpression von CybLfiihrt zur Inhibition von Komplex II III
5.3.2 Die Induktion von Apoptose durch Oberexpression von CybL benötigt eine intakte
Atmungskette _ 112
5.3.3 Diverse Apoptosestimuli benötigen zur Induktion von Apoptose einen intakten
Komplex II der Atmungskette. , 113
5.4 SAIP ALS TEIL EINES APOPTOSE SENSORS DES ENDOPLASMATISCHEN RETIKULUMS 117
5.4.1 Im ER existieren Apoptose Sensoren. 117
6 ZUSAMMENFASSUNG : 128
7 LITERATUR . 130
3
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