Die humane Komplementfaktor-H-Genfamilie: Organisation, Struktur und Expression
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I
NHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
7
1.1
DAS
KOMPLEMENTSYSTEM
.
7
1.1.1
DER
MBL-WEG
.
8
1.1.2
DER
ALTERNATIVE
KOMPLEMENTAKTIVIERUNGSWEG
.
9
1.1.3
DER
KLASSISCHE
KOMPLEMENTAKTIVIERUNGSWEG
.
10
1.1.4
DER
MEMBRANANGRIFFSKOMPLEX
(MAC)
.
10
1.2
REGULATION
DER
KOMPLEMENTAKTIVIERUNG
.
13
1.2.1
REGULATION
DES
KLASSISCHEN
KOMPLEMENTWEGES
UND
DES
MBL-WEGES
.13
1.2.2
REGULATION
DES
ALTERNATIVEN
KOMPLEMENTWEGES
.
14
1.2.3
REGULATION
DES
MAC
.
14
1.3
FAKTOR
H
UND
DIE
FAKTOR
H-FAMILIE
.
15
1.3.1
FAKTOR
H
.
15
1.3.1.1
FUNKTION
VON
FAKTOR
H
.
15
1.3.1.2
STRUKTUR
VON
FAKTOR
H
.
17
1.3.1.3
STRUKTUR,
EXPRESSION
UND
REGULATION
DES
FAKTOR
H-CENS
(HF1)
.
18
1.3.2
DIE
FAKTOR
H-FAMILIE
.
19
1.3.2.1
STRUKTUR
DER
FHRP
.
20
1.3.2.2
MOEGLICHE
FUNKTIONEN
DER
FHRP
.
21
1.3.2.3
REGULATION
UND
EXPRESSION
DER
GENE
HF2
5
.
22
1.4
DIE
GENETIK
DES
KOMPLEMENTSYSTEMS
.
22
1.4.1
GENETISCHE
LOKALISATION
UND
GENSTRUKTURWICHTIGER
KOMPLEMENTFAKTOREN
.
23
1.4.2
CHARAKTERISTIKA
DER
GENE
UND
DER
BETREFFENDEN
PROTEINE
DES
RCA-KOM
PLEXES
.
23
1.5
KOMPLEMENTAKTIVIERUNG
UND
PATHOLOGISCHE
PROZESSE
.
26
1.5.1
KOMPLEMENTMANGEL-SYNDROME
.
26
1.5.2
KOMPLEMENT
UND
KRANKHEITEN
.
27
1.5.2.1
KOMPLEMENT
UND
RHEUMATISCHE
ARTHRITIS
(RA)
.
27
1.5.2.2
KOMPLEMENT
UND
KRANKHEITEN
DES
ZENTRALEN
NERVENSYSTEMS
.
29
1.5.2.2.1
KOMPLEMENT
UND
MULTIPLE
SKLEROSE
.
30
1.5.2.2.2
KOMPLEMENT
UND
ALZHEIMER
.
31
2
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
32
2.1
GENOMISCHE
ORGANISATION
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
.
32
2.2
DELETIONEN
UND
GENORGANISATION
DER
GENE
HF2
UND
HF3
.
32
2.3
EXPRESSION
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
IM
GEHIRN
UND
IN
GLIOMAZELLINIEN
.
33
3
MATERIAL
.
34
3.1
ABKUERZUNGEN
.
34
3.2
GERAETE
.
36
3.3
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
36
3.4
KITS
.
38
3.5
ENZYME
.
38
3.5.1
RESTRIKTIONSENZYME
.
38
3.5.2
SONSTIGE
ENZYME
.
39
3.6
OLIGONUKLEOTIDE
UND
PCR-BEDINGUNGEN
.
39
3.6.1
OLIGONUKLEOTIDE
ZUR
PCR-AMPLIFIZIERUNG
VON
HF1
-SEQUENZEN
.
39
3.6.2
OLIGONUKLEOTIDE
ZUR
PCR-AMPLIFIZIERUNG
VON
HF2-SEQUENZEN
.
40
3.6.3
OLIGONUKLEOTIDE
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
VON
HF3-SEQUENZEN
.
40
3.6.4
OLIGONUKLEOTIDE
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
VON
HF4
UND
HF5-SEQUENZEN
.
40
3.6.5
OLIGONUKLEOTIDE
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
VON
NEU
IDENTIFIZIERTEN
HF1-VERWAND
TEN
CENSEQUENZEN
.
41
3.6.6
OLIGONUKLEOTIDE
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
VON
F13B
.
41
3.6.7
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
ALU-PCR
.
41
3.6.8
YAC-SPEZIFISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
41
3.6.9
WEITERE
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
42
3.7
ANTIKOERPER
.
42
3.7.1
ANTIKOERPER
GEGEN
FAKTOR
H
UND
FAKTOR
H
VERWANDTE
PROTEINE
.
42
3.7.2
ANTIKOERPERKONJUGATE
.
43
3.8
VERWENDETE
ORGANISMEN
UND
VEKTOREN
.
43
3.8.1
BAC
UND
PBELOBAC1
1
.
43
3.8.2
S.
CEREVISIAE
AB1380
UND
PYAC4
.
44
3.8.3
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
.
45
4
METHODEN
.
46
4.1
ARBEITEN
MIT
DNS
.
46
4.1.1
ISOLIERUNG
VON
DNS
.
46
4.1.1.1
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
BAKTERIENZELLEN
(KLEINANSATZ)
.
46
4.1.1.2
PLASMIDISOLIERUNGAUS
BAKTERIENZELLEN
(MITTELANSATZ)
.
47
4.1.1.3
ISOLIERUNG
VON
BAC-DNS
.
47
4.1.1.4
ISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
HEFEZELLEN
.
47
4.1.1.5
HERSTELLUNG
VON
DNS-BLOECKCHEN
FUER
DIE
PFGE
.
48
4.1.1.6
ISOLIERUNG
CENOMISCHER
DNS
AUS
ZELLEN
UND
GEWEBE
.
50
4.1.1.7
ISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
PRAEPARATIVEN
AGAROSEGELEN
.
50
4.1.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNS,
RNS
UND
OLIGONUKLEOTIDEN
.
51
4.1.2.1
FOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
51
4.1.2.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
UEBER
AGAROSEGELE
.
51
4.1.3
RESTRIKTION
VON
DNS
.
52
4.1.3.1
RESTRIKTION
VON
PLASMID-DNS
.
52
4.1.3.2
RESTRIKTION
VON
BAC-DNS
.
52
4.1.3.3
RESTRIKTION
GENOMISCHER
DNS
.
53
4.1.3.4
RESTRIKTION
VON
DNS-BLOECKCHEN
FUER
DIE
PFGE
.
53
4.1.4
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UND
KAPILLARTRANSFER
.
55
4.1.4.1
TBE
UND
TPE-AGAROSEGELE
.
55
4.1.4.2
PF-GELE
.
56
4.1.5
NICHTRADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
57
4.1.5.1
HERSTELLUNG
VON
DIG-MARKIERTEN
DNS-SONDEN
.
58
4.1.5.2
HERSTELLUNG
VON
DIG-MARKIERTEN
DNS-SONDEN
FUER
DIE
KARTIERUNG
VON
YAC
.
58
4.1.5.3
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHERN-UND
NORTHERNBLOTS
.
59
4.1.5.4
IMMUNDETEKTION
.
59
4.1.5.5
ENTFERNEN
DIG-MARKIERTER
DNS-SONDEN
VON
SOUTHERNBLOTS
(STRIPPING)
.
60
4.1.6
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA
.
60
4.1.7
PCR-AMPLIFIKATION
VON
GROSSEN
FRAGMENTEN
(LONG
RAENGE
PCR)
.
61
4.1.8
SUBKLONIEREN
VON
PCR-PRODUKTEN
.
61
4.1.9
SEQUENZIERUNG
.
62
4.1.9.1
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
ZUR
DIREKTEN
SEQUENZIERUNG
.
.
63
4.1.9.2
SEQUENZIERUNG
VON
SUBKLONIERTEN
PCR-PRODUKTEN
MIT
ABI
.
63
4.1.9.3
SEQUENZIERUNG
MIT
ALFEXPRESS
.
64
4.2
ISOLIERUNG
VON
YAC
UND
BAC-KLONEN
AUS
DEN
BIBLIOTHEKEN
VON
RESEARCH
GENETICS
.
64
4.2.1
AUFFINDEN
VON
YAC-KLONEN
.
64
4.2.2
REINIGUNG
VON
YAC-KLONEN
.
65
4.2.3
PCR-AMPLIFIKATION
AUS
HEFEZELIEN
.
65
4.2.4
AUFFINDEN
VON
BAC-KLONEN
.
65
4.2.5
IDENTIFIKATION
POSITIVER
BAC-KLONE
AUS
395-VERTIEFUNGSPLATTEN
.
66
4.3
ARBEITEN
MIT
RNS
.
67
4.3.1
ISOLIERUNG
VON
RNS
.
67
4.3.2
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
RNS
UND
KAPILLARTRANSFER
.
68
4.3.3
REVERSE
TRANSKRIPTION
VON
RNA
UND
RT-PCR
.
69
4.4
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
.
69
4.4.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
69
4.4.2
WESTERNBLOT
.
70
4.4.3
IMMUNDETEKTION
VON
WESTERNBLOTS
.
71
4.5
ZELLKULTUR
.
72
4.5.1
KULTIVIERUNG
VON
GLIOMAZELLINIEN
.
72
4.5.2
STIMULIERUNG
VON
GLIOMAZELLINIEN
MIT
IFNG,
IL4
UND
IL6
.
73
5
ERGEBNISSE
.
74
5.1
DIE
GENOMISCHE
ORGANISATION
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
.
74
5.1.1
ANALYSE
VON
FAKTOR
H-YAC-KLONEN
.
74
5.1.1.1
DIFFERENZIERUNG
VON
HF1
UND
HF2-GENSEGEMENTEN
UEBER
PCR
UND
PVU
IL-VERDAU
.
74
5.1.1.2
SEQUENZIERERGEBNISSE
.
78
5.1.1.3
SOUTHERNBLOTHYBRIDISIERUNGEN:
VERGLEICH
YAC-DNS
MIT
GENOM
ISCHER
DNS
.
79
5.1.2
TEST
AUF
CHIMAERISMUS
.
81
5.1.3
RESTRIKTIONSKARTEN
DER
YAC
.
82
5.1.3.1
AUFFINDEN
DER
HF-GENE
AUF
DEN
YAC
.
88
5.1.4
ANALYSE
DER
FAKTOR
H-BAC
.
96
5.1.4.1
PCR-ERGEBNISSE
.
96
5.1.4.2
SEQUENZIERERGEBNISSE
.
97
5.1.4.3
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
NACH
PFGE
UND
RESTRIKTIONSKARTEN
DER
BAC
.
98
5.1.4.4
HINWEIS
AUF
EIN
WEITERES
FAKTOR
H
VERWANDTES
GEN
.
105
5.2
EXPRESSION
UND
ORGANISATION
DER
GENE
HF2
UND
HF3
.108
5.2.1
GENOMISCHE
ORGANISATION
VON
HF2
UND
HF3
.
108
5.2.3
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DELETIONEN
IN
DER
HF-GENFAMILIE
.
111
5.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
POLYMORPHISMUS
DES
HF2-GENS
.
112
5.3.1
GRUNDLAGEN
ZUM
HF2-POLYMORPHISMUS
.
113
5.3.2
DIE
HF2-DELETION
IN
RHEUMAPATIENTEN
UND
KONTROLLPERSONEN
.
114
5.4
EXPRESSION
DER
HF-GENFAMILIE
IM
GEHIRN
UND
IN
GLIOMAZELLINIEN
.
114
5.4.1
WESTERNBLOTANALYSEN
ZUM
NACHWEIS
VON
FAKTOR
H,
FHRP1
UND
FHRP2
IN
LIQUOR
.
115
5.4.2
NORTHERNBLOTANALYSEN
ZUM
NACHWEIS
DER
HF-GENFAMILIE
IN
HIRNGEWEBEN
UND
GLIOMAZELLINIEN
.116
6
DISKUSSION
.
121
6.1
GENETIK
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
.
121
6.1.2
PROBLEME
BEI
DER
GENETISCHEN
ANALYSE
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
.
125
6.1.3
EVOLUTION
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
.
125
6.1.4
HOMOLOGIEN
UND
DUPLIKATIONEN
BEI
DEN
GENEN
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
.127
6.1.5
DUPLIKATIONEN
UND
DELETIONEN
IN
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
.128
6.2
EXPRESSION
DER
FAKTOR
H-GENFAMILIE
IM
GEHIRN
UND
IN
HIRNZELLINIEN
.130
6.2.1
EXPRESSIONSMUSTER
UND
FUNKTION
DER
HF-GENFAMILIE
IM
GEHIRN
UND
IN
GLIOMAZELLINIEN
.
130
6.2.2
REGULATION
DER
EXPRESSION
DER
HF-GENFAMILIE
IN
GLIOMAZELLINIEN
DURCH
INFY,
IL4
UND
IL6
.
133
7
ZUSAMMENFASSUNG
.136
8
LITERATURVERZEICHNIS
.138
9
ANHANG
.146 |
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