Analyse der Expression einer Virulenzgenfamilie von Candida albicans während der Infektion:
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG. 1
1 SUMMARY.4
2 EINLEITUNG.-.7
2.1 ALLGEMEINE
EINFUEHRUNG.7
2.2 DISKUTIERTE VIRULENZFAKTOREN VON
CANDIDA ALBICANS.9
2.3 GENEXPRESSIONSANALYSE DURCH REPORTERSYSTEME
.17
2.4 ZIELSETZUNG DIESER
ARBEIT.22
3 MATERIAL UND METHODEN.23
3.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME UND
PLASMIDE.23
3.1.1
ESCHERICHIA COLI K 12-STAMM.23
3.1.2 PLASMIDE.23
3.2 VERWENDETE
CANDIDA
AFOE{CANS STAMME.26
3.3 OLIGONUKLEOTIDE.29
3.4 GERAETE UND CHEMIKALIEN. 31
3.5 MIKROBIOLOGISCH-MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
(E. COLI).32
3.5.1 ANZUCHT DER
E. CO/I-STAEMME.33
3.5.2 PLASMIDISOLIERUNG.33
3.5.3 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).33
3.5.4 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.34
3.5.5 AUFREINIGUNG VON DNA DURCH AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.35
3.5.6 LIGATION UND TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA.35
3.5.7 DNA-SEQUENZIERUNG.36
3.5.8 SITE-SPEZIFISCHE MUTAGENESE.37
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.6 MIKROBIOLOGISCH-MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN (C.
ALBICANS)_.38
3.6.1 ANZUCHT DER
C. ALBICANS-ST&MMT.38
3.6.2 GENETISCHE TRANSFORMATION VON C.
ALBICANS DURCH ELEKTROPORATION.38
3.6.3 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA AUS C.
ALBICANS.40
3.6.4 SOUTHEM-HYBRIDISIERUNG.40
3.6.5 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS
C. ALBICANS.41
3.6.6 NORTHERN HYBRIDISIERUNG.42
3.6.7 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.43
3.6.8 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHER NACHWEIS DER GFP-EXPRESSION.44
3.7
IN WVO-EXPERIMENTE. , ,.DAE
4 ERGEBNISSE.47
4.1 ETABLIERUNG EINER
IN WVO-FIXPRESSIONSTECHNOLOGIE (IVET) FUER C. ALBICANS _.-.-.47
4.1.1 FUNKTIONSPRINZIP DES REPORTERSYSTEMS.47
4.1.2 HERSTELLUNG EINES C.
ALBICANS-STAMMES MIT DELETIERBAREM MARKER.49
4.1.3 INTEGRATION DES
CAFLP-GENS IN DEN C. ALBICANS-SAP2-LOKUS.51
4.1.4 UEBERPRUEFUNG DES REPORTERSYSTEMS
IN VITRO.53
4.1.4.1 SPEZIFISCHE FLP-VERMITTELTE DELETION DES A/PA*-MARKERS.53
4.1.4.2 DETEKTION DER SAP2P-INDUZIERTEN FLP-AKTIVITAET AUF
EINZELZELLEBENE.55
4.1.4.3 KORRELATION DER FLP-AKTIVITAET MIT DER SAP2-EXPRESSION.57
4.1.5 VERWENDUNG DES REPORTERSYSTEMS
IN VIVO.58
4.1.5.1 ANALYSE DER SAP2-EXPRESSION NACH INTRAPERITONEALER INFEKTION.59
4.1.5.2 ANALYSE DER S4P2-EXPRESSION NACH INTRAVENOESER INFEKTION.61
4.1.5.3 ANALYSE DER &4P2-EXPRESSION NACH ORALER INFEKTION. 62
4.2 ANALYSE DER
IN VITRO- UND IN VIVO-REGULATION DES SAP2-GEAS.--.YY.YY64
4.2.1 IDENTIFIZIERUNG EINER AUFFAELLIGEN REPEATSTRUKTUR IM
SAP2-PROMOTOR.64
4.2.2 EINFLUSS DER GESAMTREPEATZAHL AUF DIE &4P2-PROMOTORINDUKTION
IN VIVO.66
4.2.2.1 HERSTELLUNG VON REPORTERSTAEMMEN MIT VERAENDERTEN
SAP2-PROMOTOREN.68
4.2.2.2 REPEATZAHL-ABHAENGIGE IN VIVO-INDUZIERBARKEIT DES
SAP2-PROMOTORS.70
4.2.3 DIFFERENTIELLE
IN VT'RRO-REGULATION DER WILDTYPISCHEN SAP2-ALLELE.73
4.2.3.1 SEQUENTIELLE INAKTIVIERUNG DER BEIDEN
SAP2-ALLELE.75
4.2.3.2 BEIDE SAP2-ALLELE WERDEN FUNKTIONELL EXPRIMIERT.78
4.2.3.3 ABHAENGIGKEIT DER EXPRESSION DES SAP2-/-ALLELS VON ALLEL
SAP2-2.82
4.2.3.4 DIFFERENTIELLE AKTIVIERBARKEIT DER WILDTYPISCHEN
SAP2-PROMOTOREN.87
4.2.4 ETABLIERUNG EINER SENSITIVEREN VERSION DES IVET-SYSTEMS.95
4.2.4.1 HERSTELLUNG DES ECAFLP-GENS DURCH SITE-SPEZIFISCHE MUTAGENESE.95
4.2.4.2 INTEGRATION DES ECAFLP-GCNS IN DEN SAP2-LOKUS.97
4.2.4.3 ERHOEHTE AKTIVITAET DER VERAENDERTEN FLP-REKOMBINASE.99
4.2.5 DIFFERENTIELLE REGULATION DER BEIDEN SA P2-ALLELE WAEHREND DER
INFEKTION
101
4.3 ANALYSE DER
IN VIVO-EXPRESSION DER GENE SAP1-SAP6
.104
4.3.1 INTEGRATION DES
ECAFLP-GENS IN DIE GENE SAP1-SAP6.104
4.3.1.1 KONSTRUKTION DER PLASMIDE.105
4.3.1.2 INTEGRATION DER REPORTERFUSIONEN IN DIE ENTSPRECHENDEN
SAP-GENE.107
4.3.2 DIFFERENTIELLE AKTIVIERUNG DER GENE
SAP1-SAP6 WAEHREND DER INFEKTION.110
4.3.2.1 STADIENSPEZIFISCHE SAP-AKTIVIERUNG NACH INTRAPERITONEALER
INFEKTION.111
4.3.2.2 DIFFERENTIELLE SAP-AKTIVIERUNG NACH INTRAVENOESER INFEKTION.112
4.3.2.3 DIFFERENTIELLE SAP-AKTIVIERUNG NACH ORALER INFEKTIQN.113
4.4 EINFLUSS VON SIGNALWEGEN AUF DIE SAP5-EXPRESSION WAEHREND DER
INFEKTION .115
4.4.1 INTEGRATION DES A/PA*-MARKERS IN
C. ALBICANS-CPHL- UND E/G/-MUTANTEN.116
4.4.2 ECOEPLP-INTEGRATION IN SAP-GENE DER REGULATORISCHEN MUTANTEN.117
4.4.3
LN VIVRO-UEBERPRUEFUNG DES IVET-SYSTEMS IN DEN REGULATORISCHEN
MUTANTEN.120
4.4.4 EINFLUSS DER TRANSKRIPTIONSREGULATOREN CPH1 UND EFG1 AUF DIE
IN V/VO-SAPS-AKTIVIERUNG.121
5 DISKUSSION.127
5.1 ETABLIERUNG EINER
IN VIVO-EXPRESSIONSTECHNOLOGIE FUER C. ALBICANS.128
5.2 REGULATION DES C.
ALBICANS SAP2-GENS: IN VITRO UND IN
VRV0.YY.133
5.3 REGULATION DER GENE
SAP1-SAP6 WAEHREND DER
INFEKTION.YY.YYYY.142
5.4 ABSCHLIESSENDE WERTUNG UND
AUSBLICK-.-.151
6 LITERATURVERZEICHNIS.153
ANHANG.A
1.
ERKLAERUNGEN.-.-.-YYYYYYYYYYYYYYYYYYYY.A.L
2. PUBLIKATIONEN.-.
.-.A.2
3.
LEBENSLAUF.-.-.A3 |
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