Funktionelle Analyse der großen Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen FKBP51, FKBP52 und Cyp40:
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INHALTSVERZEICHNIS
1NHALTSVERZEICHNIS I-IV
1. EINLEITUNG 1
1.1. EINFIIHRUNG
1
1.2. PROTEINFALTUNG
IN VITRO UND IN VIVO 1
1.3. FALTUNGSKATALYSATOREN 3
1.3.1. PROTEIN-DISULFLD-ISOMERASEN 3
1.3.2. PEPTIDYL-PROLYL-CIS/TRANS ISOMERASEN 4
1.4. MOLEKULARE CHAPERONE 9
1.5. HSP90 UND DER MULTICHAPERONKOMPLEX 11
1.6. DIE GROFIEN IMMUNOPHILINE 16
1.6.1. FKBP52 16
1.6.2. FKBP51 18
1.63. CYP40 18
1.6.4. ROLLE IM HSP90-MULTICHAPERONKOMPLEX 19
1.7. PROBLEMSTELLUNG
22
2. MATERIAL UND METHODEN 23
2.1. VERWENDETE MATERIALIEN
23
2.1.1. CHEMIKALIEN 23
2.13. PROTEINE 24
2.13. PEPTIDE 24
2.1.4. BAKTERIENSTAMME 25
2.1.5. PLASMIDE 25
2.1.6. PCR-PRIMER 26
2.1.7. MOLEKULARBIOLOGISCHE STANDARDS UND KITS 27
2.1.8. ANTIBIOTIKA UND MEDIEN 27
2.1.9. PUFFER UND LOSUNGEN 27
2.1.9.1. LOSUNGEN FUR GENTECHNISCHE METHODEN 27
2.1.9.2. PUFFER FUR PREPARATIVE UND PROTEINCHEMISCHE METHODEN 28
2.1.10. STANDARD-CHROMATOGRAPHIEMATERIALIEN UND -SAULEN 28
2.1.11. SONSTIGES MATERIAL 28
2.1.12. GERLTE 29
2.1.13. COMPUTERPROGRAMME 30
II
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 31
2.2.1. KULTIVIENING UND KONSERVIERUNG VON E. COLI STAMMEN (SAMBROOK ET
AL., 31
1989)
2.2.2. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 31
2.23 PCR-AMPLIFIKATION (MULLIS UND FALOONA, 1987) 31
2.2.4. ENZYMATISCHE MODIFICATION VON DNA 32
2.2.4.1. SCHNEIDEN VON DNA MITTELS RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 32
2.2.4.2. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 33
2.2.4.3. LIGATION VON DNA-ENDEN 33
2.2.5. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA (SAMBROOK ET AL., 1989) 33
2.2.6. TRANSFORMATION VON E. COLI -ZELLEN 33
2.3. PREPARATIVE METHODEN
34
2.3.1. PROTEINEXPRESSION UND ERNTE 34
2.3.2. PROTEINREINIGUNG 34
2.3.2.1. IONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE 35
2.3.2.2. AFFINITATSCHROMATOGRAPHIE 35
2.3.2.3. PRSPARATIVE GELFILTRATION 35
2.33. AUFKONZENTRIERUNG UND DIALYSE 36
2.4. PROTEINCHEMISCHE METHODEN 36
2.4.1. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 36
2.4.2. F&R BE METHODEN 36
2.43. IMMUNOBLOTTING 37
2.4.4. PROTEIN-SEQUENZBLOT 37
2.4.5. PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD (BRADFORD, 1976) 38
2.5. SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 38
2.5.1. UV-VIS-SPEKTROSKOPIE 38
2.5.2. FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE 39
2.53. CIRCULARDICHROISMUS 40
2.6. STABILITATSMESSUNGEN 41
2.6.1. CHEMISCHE DENATURIERUNG UND RENATURIERUNG 41
2.6.2. THERMISCHE DENATURIERUNG 42
2.7. MESSUNGEN ZUM OLIGOMERISIERUNGSZUSTAND 43
2.7.1. ANALYTISCHE GELFILTRATION 43
2.7.2. ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGATION 43
2.8. PROTEIN-PROTEIN-LNTERAKTIONSSTUDIEN 43
2.8.1. BIACORE: PLASMON-RESONANZ-SPEKTROSKOPIE 43
2.8.2. ISOTHERMISCHE TITRATIONSKALORIMETRIE 44
2.9. BESTIMMUNG DER PPIASE-AKTIVITAT 45
2.9.1. PROTEASE-GEKOPPELTER PEPTIDASSAY 45
2.9.2. PROTEASE-FREIER PEPTIDASSAY 45
2.93. RCM-T1 RIICKFALTUNGSASSAY 45
III
INHALTSVERZEICHNIS
2.10. CHAPERON-ASSAYS
46
3. ERGEBNISSE 47
3.1. VERGLEICH DER GROFIEN IMMUNOPHILINE FKBP51, FKBP52 UND
CYP40 47
3.1.1. ALLGEMEINER VERGLEICH VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 47
3.1.2. REINIGUNG VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 49
3.1.3. STRUKTUR UND STABILIT&T VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 52
3.1.3.1. STRUKTUR VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 52
3.1.3.2. STABILITY VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 59
3.1.4. INTERAKTION VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 MIT HSP90 64
3.
1.4.1. BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN MITTELS PLASMON-RESONANZ-
SPEKTROSKOPIE 64
3.1.4.2. ISOTHERMISCHE TITRATIONSKALORIMETRIE 66
3.1.5. PEPTIDYL-PROLYL-CIS/TRANS ISOMERASE-AKTIVITAT VON FKBP51, FKBP52
UND 69
CYP40
3.1.5.1. PPIASE-AKTIVITAT IM PEPTIDASSAY 69
3.1.5.2. PPIASE-AKTIVITAT IM RCM-T1 RTICKFALTUNGSASSAY 72
3.1.6.
AKTIVITAT VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 ALS 74
MOLEKULARE CHAPERONE
3.2. LOKALISATION VON FUNKTIONELLEN EINHEITEN DER GROFIEN IMMUNO- 77
PHLLINE ANHAND VON FRAGMENTEN VON FKBP52
3.2.1. PLANUNG UND REINIGUNG DER EINZELNEN FRAGMENTE 77
3.2.2. STRUKTUR UND STABILITY DER FKBP52-FRAGMENTE 79
3.2.3. PEPTIDYL-PROLYL-CIS/TRANS ISOMERASE-AKTIVITLT DER
FKBP52-FRAGMENTE 83
3.2.3.1. PPIASE-AKTIVITAT IM PEPTIDASSAY 83
3.2.3.2. PPIASE-AKTIVITAT IM RCM-T1 RTICKFALTUNGSASSAY 85
3*2.4.
AKTIVITAT DER FKBP52-FRAGMENTE ALS MOLEKULARE 87
CHAPERONE
3.2.5. INTERAKTION VON FKBP52 MIT DEM C-TERMINALEM HSP90-PEPTID 89
HSP90C17
3.2.6. KOMPETITIONSMESSUNGEN MIT FKBP52 UND HSP90C17 IM CS-ASSAY 90
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4. DISKUSSION
92
4.1. FUNKTIONELLE ANALYSE DER GROFIEN IMMUNOPHILINE FKBP51,
92
FKBP52 UND CYP40
4.1.1. STRUKTUR UND STABILITAT VON FKBP51, FKBP52 UND CYP40 92
4.1.2. PPIASE-AKTIVITAT DER GROFIEN IMMUNOPHILINE 94
4.1.3. BINDUNG DER GROFIEN IMMUNOPHILINE AN HSP90 95
4.1.4. INTERAKTION MIT NICHT-NATIVEN PROTEINEN UND ROLLE IM
REZEPTORKOMPLEX 97
4.2. LOKALISATION
DER
FUNKTIONELLEN ELEMENTE VON FKBP52
98
4.2.1 STRUKTUR UND STABILITAT DER FKBP52-FRAGMENTE 98
4.2.2. LOKALISATION DER PPIASE-AKTIVITAT VON FKBP52 IN DOMANE 1 99
4.2
3. LOKALISATION DER CHAPERON-AKTIVITIT VON FKBP52 99
4.2.4. BINDUNG AN H$P90 UND NICHT-NATIVE PROTEINE 100
5. ZUSAMMENFASSUNG
103
6. LITERATURVERZEICHNIS
106
7. ABKIIRZUNGEN
120
8. PUBLIKATIONEN
122
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