Identifikation signaltransduktionsrelevanter Gene in Melanomzelllinien durch Entwicklung und Anwendung eines Verfahrens zur Analyse von Daten aus cDNA-Hybridisierungsarrays:
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2001
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INHALT
1. EINLEITUNG.
1
1.1 VORKOMMEN, ENTSTEHUNG UND PROGRESSION VON MELANOMEN.
1
1.1.1 HISTOLOGISCHE BEURTEILUNG VON MELANOMEN.2
1
.
1.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE VERAENDERUNGEN IM VERLAUF DER
T UMORPROGRESSION.4
1.3 TRANSKRIPTOM-ANALYSE MIT CDNA-HYBRIDISIERUNGS-ARRAYS.
6
1.3.1 ANWENDUNG VON CDNA-ARRAYS. 7
1.3.2 ARTEN VON CDNA-ARRAYS.
8
1.4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT.10
1.4.1 ENTWICKLUNG EINER METHODE ZUR AUSWERTUNG VON DATEN AUS CDNA-
ARRAYS .
10
1.4.2 ANALYSE DER EXPRESSION AUSGEWAEHLTER GENE IN MELANOM-ZELLLINIEN
UND FINDEN MOEGLICHER THERAPEUTISCHER ZIELMOLEKUELE MIT CDNA-
ARRAYS .
10
1.4.3 EXEMPLARISCHE UNTERSUCHUNG DER ROLLE GEFUNDENER GENE IN
MELANOM-ZELLLINIEN.
10
2
. MATERIAL UND METHODEN.
11
2.1
BEZUGSQUELLENNACHWEIS.
11
2
.
1.1
CHEMIKALIEN.
11
2.1.2 ENZYME.
12
2
.
1
.3 RADIOCHEMIKALIEN.
12
2.1.4 YYKITS" UND SONSTIGES.
12
2.2 MEDIEN UND PUFFER.
13
2.2.1 MEDIUM FUER E.COLI BAKTERIEN.
13
2.2.2 ZELLKULTURMEDIEN.
13
2.2.3 STAMMLOESUNGEN UND HAEUFIG VERWENDETE PUFFER.14
2.3 BAKTERIENSTAEMME, ZELLINIEN UND ANTIKOERPER.
15
2.3.1 BAKTERIENSTAEMME.
15
2.3.2 ZELLLINIEN.
15
2.3.3 ANTIKOERPER.16
2.4 PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE.
17
2.4.1 PLASMIDE.
17
2.4.2 OLIGONUKLEOTIDE.
1
8
2.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN. 18
2.5
.1
PLASMIDPRAEPARATION FUER ANALYTISCHE ZWECKE ("MINI-PREP").18
2.5.2 PLASMIDPRAEPARATION FUER PRAEPARATIVE ZWECKE ("MAXI-PREP").18
2.5.3 ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA.
1
8
2.5.4 GELELEKTROPHORESE VON DNA.
19
2.5.5 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.
19
2.5.6 DNA-TRANSFER IN E.COLI BAKTERIEN.
19
2.5.7 SEQUENZIERUNG.
19
2.5.8 AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN DURCH PCR. 20
2.5.9 HERSTELLUNG VON RNA UND CDNA.20
2.5.10 DETEKTION VON RNA MIT NORTHERN BLOTS.21
2.5.1
1
HERSTELLUNG REKOMBINANTEN GST-A-HEREGULIN FUSIONSPROTEINS IN
E.COLI
21
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/963179489
2.6 CDNAARRAYS.22
2.6.1 HERSTELLUNG DER MEMBRANEN FUER CDNA-ARRAYS.22
2.6.2 RADIOKTIVE MARKIERUNG DER CDNA-PROBEN.23
2.6.3 HYBRIDISIERUNG UND WASCHEN DER MEMBRANEN.23
2.6.4 EINLESEN UND SPEICHERN DER ARRAYS MIT DEM PHOPHOIMAGER.23
2.6.5 VERWENDUNG DES PROGRAMMES "ARRAYVISION 5.1".24
2.7 METHODEN ZUR ARBEIT MIT EUKARYONTISCHEN ZELLEN.36
2.7.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN.36
2.7.2 TRANSFEKTIONEN. 36
2.7.3 RETROVIRALER GENTRANSFER IN MELANOMZELLLINIEN.37
2.7.4 MTT-WACHSTUMSASSAYS. 37
2.8 PROTEINANALYTISCHE METHODEN.38
2.8.1 TRITON X-100 LYSE VON ZELLEN.38
2.8.2 PROTEINBESTIMMUNG.38
2.8.3 IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN. 38
2.8.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.39
2.8.5 FAERBUNG UND FIXIERUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN.39
2.8.6 TRANSFER VON PROTEINEN AUF NITROZELLULOSEMEMBRANEN.39
2.8.7 IMMUNDETEKTION (WESTERN BLOT ANALYSE).39
2.8.8 DEGLYKOSILIERUNG VON HER3.
7:.
.40
2.9 KULTIVIERUNG VON MELANOMZELLLINIEN IN NACKTMAEUSEN.40
3. ERGEBNISSE. 41
3.1 ENTWICKLUNG EINER VORGEHENSWEISE ZUR AUSWERTUNG VON
GENEXPRESSIONSDATEN AUS CDNA-HYBRIDISIERUNGS-ARRAYS.41
3.1.1 AQUISITION DER DATEN.41
3.1.2 NORMALISIERUNG.43
3.1.3 BESTIMMUNG DER DETEKTIONSGRENZE.43
3.1.4 PROGRAMMIERUNG UND ANWENDUNG VON "GENEFISH".44
3.2 ERGEBNISSE AUS "GENEFISH".49
3.3 ERMITTLUNG VON ARRAYGRUPPEN ("CLUSTERN") AUF DER BASIS IHRER
EXPRESSIONSPROFILE.57
3.3.1 ANWENDUNG DER PROGRAMME "CLUSTER" UND "TREEVIEW".58
3.3.2 KORRELATION VON TUMORIGENITAET DER ZELLLINIEN IM NACKTMAUSMODELL
MIT EXPRESSIONSPROFILEN AUS CDNA-ARRAYS.59
3.4 GENEXPRESSIONEN NACH WACHSTUM VON ZELLLINIEN IN NACKTMAEUSEN.60
3.5 UNTERSUCHUNG VON HER3.61
3.5.1 UEBERPRUEFUNG DER EXPRESSIONSDATEN.61
3.5.2 HERSTELLUNG EINER DOMINANT NEGATIVEN MUTANTE VON HER3.64
3.5.3 EINFUEHRUNG DER MUTANTE H3-X-F IN MELANOMZELLLINIEN.66
3.5.4 EIGENSCHAFTEN DER TRANSGENEN ZELLLINIEN.68
3.6 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERUNG VON FAK DURCH HER3.72
4. DISKUSSION.74
4.1 DATENANALYSE DER CDNA-ARRAYS.74
4.1.1 MIT "GENEFISH" GEFUNDENE GENE.74
4.1.2 MIT "CLUSTER" GEFUNDENE GENE.77
4.1.3 EXPRESSIONSVERGLEICH ZELLKULTUR-NACKTMAUS.78
4.2 UNTERSUCHUNG VON HER3.79
5. ZUSAMMENFASSUNG.81
6. LITERATUR.82 |
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