Expression und Funktion von AP-2-Transkriptionsfaktoren während der Entwicklung von ektodermalen, neuroektodermalen und urogenitalen Geweben: Erzeugung transgener Nagermodelle zum Verständnis der Regulation und In-vivo-Funktion von AP-2-Genen
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2001
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I ZUSAMMENFASSUNG
1
N EINLEITUNG.3
II. L MOLEKULARE ASPEKTE DER NIERENENTWICKLUNG.3
II. L. 1 SIGNALE AUS DEM MESENCHYM VERANLASSEN DIE URETERBILDUNG.4
II. L .2 SIGNALE AUS DEM URETER UND DEM MESENCHYM SELBST REGULIEREN DIE
DIFFERENZIERUNG DES MESENCHYMS.7
11.2 GEZIELTE GENINAKTIVIERUNG IM MODELLSYSTEM MAUS: YYGENE
TARGETING".10
II. 3 DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR AP-2: MEDIATOR ZELLULAERER
DIFFERENZIERUNG.14
II. 3. L DIE BEDEUTUNG VON AP-2 FUER DIE REGULATION VON APOPTOSE UND
ZELLZYKLUS 17
11.3.2 DER PHAENOTYP DER AP-2A YYKNOCKOUT" MAUS.20
II. 3.3 AP-2REP UND MEHMET: ZWEI POTENTIELLE REGULATOREN DER AP-2
AKTIVITAET.23
FFL ERGEBNISSE.27
III. 1 VORARBEITEN: KLONIERUNG EINES ZWEITEN AP-2 HOMOLOGEN
TRANSKRIPTIONSFAKTORS: AP2SS. 27
111.2 VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSIONSVERTEILUNG VON AP-2OC
UND
AP-2SS.29
111.2.1 VERGLEICHENDE AP-2 EXPRESSION WAEHREND EMBRYONALER
DIFFERENZIERUNGSVORGAENGE.30
III. 2.2 VERGLEICHENDE AP-2 EXPRESSION IN ADULTEN GEWEBEN
.37
III.2.3 VERGLEICHENDE AP-2 EXPRESSION IN ZELLLINIEN UND NEOPLASTISCHEN
GEWEBEN.39
111.3 ERZEUGUNG EINER AP-2SS DEFIZIENTEN MAUSMUTANTE.40
III. 3.1 KLONIERUNG DES MURINEN AP-2SS GENLOKUS UND ERZEUGUNG DES AP-2SS
YY TARGETING "-VEKTORS.41
111.3.2 HOMOLOGE REKOMBINATION DES YYTARGETING"-VEKTORS IN EMBRYONALE
STAMMZELLEN UND
INJEKTION VON ES-ZELLEN IN MAUSBLASTOZYTEN ZUR ERZEUGUNG
KEIMBAHNGAENGIGER CHIMAERER
FOUNDERTIERE.42
111.3.3 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DER AP-2SS MUTANTEN UND BESTAETIGUNG
DER
INAKTIVIERUNG DES AP-2SS GENS
.43
111.3.4 ANALYSE DES AP-2SS GENS IN ASPKD PATIENTEN.47
111.3.5 ERHOEHTER APOPTOTISCHER ZELLTOD IN NIERENEPITHELZELLEN
.48
111.3.6 UNTERSUCHUNGEN DER CALCIUMREGULATION IN AP-2SSMAUSMUTANTEN
.53
111.4 ERZEUGUNG VON MAUSMUTANTEN
AP-2A REGULATORISCHER GENE.58
111.4.1 DIE AP-2REP YYKNOCKOUT" MAUS
.58
111.4.2 DIE MEHMET YYKNOCKOUT" MAUS
.61
TV
DISKUSSION.69
IV. 1 KLONIERUNG EINES ZWEITEN AP-2 HOMOLOGEN TRANSKRIPTIONSFAKTORS.
INDIZ EINER
AP-2 GENFAMIUE. 69
IV.2 AP-2
EXPRESSION IN NEUROEKTODERMALEN, EKTODERMALEN UND UROGENITALEN
GEWEBEN.71
IV.3 ANALYSE DER
AP-2SS YYKOCKOUT" MAUS.74
IV.3.1 AP-2SSDEFIZIENTE MAEUSE ENTWICKELN POLYZYSTISCHE NIEREN.75
IV. 3.2 ERHOEHTER APOPTOTISCHER ZELLTOD IN NIERENEPITHELZELLEN.76
IV. 3.3 AP-2SS MUTATIONEN IN DER HUMANEN KEIMBAHN
.78
IV.3.4 HYPOKALZIAEMIE UND HYPERPARATHYREOIDISMUS IN AP-2SSMAUSMUTANTEN
.81
IV.4 AP-2 EXPRESSION IN MALIGNEN TUMOREN.83
IV.5 MAUSMODELLE AP-2 REGULATORISCHER GENE.85
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/962726516
IV.5.1 DIEAP-2REP "KNOCKOUT" MAUS
.86
IV.5.2 MEHMET DEFIZIENTE TIERE ENTWICKELN EXENZEPHALIE UND SCHWERE
FAZIALE DEFEKTE.87
V AUSBLICK.90
VI MATERIAL UND METHODEN.92
VI. 1 MATERIAL.92
VI. 1.1 MATERIALIEN ALLGEMEIN.92
VI. 1.2 GERAETE
. 93
VI. 1.3 ORGANISMEN
.93
VI. 1.4 VEKTOREN
.94
VI. 1.5 OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.95
VI. 1.6 MEDIEN, ANTIBIOTIKA UND PUFFER.
.
97
VI.2 METHODEN.101
VI.2.1 KULTIVIERUNG VON ESCHERICHIA COLI STAEMMEN.101
VI.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI.101
VI.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM KLEINEN MASSSTAB
(MINIPRAEPAMTION).101
VI.2.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM GROSSEN MASSSTAB
(MAXIPRAEPARATION).102
VI.2.3 TRANSFORMATION VON E. COLI MIT PLASMID-DNA.102
VI.2.3.1 HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN E. COLI-ZELLEN ZUR AUFNAHME VON
PLASMID-DNA.102
VI.2.3.2 TRANSFORMATION.103
VI.2.4 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.103
VI.2.5 GELELEKTROPHORESE VON DNA.103
VI.2.6 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN.103
VI.2.6.1 ISOLIERUNG AUS POLYACRYLAMIDGELEN.103
VI.2.6.2 ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN.104
VI.2.
7
DNA- UND RNA-KONZENTRATRIONSBESTIMMUNG.104
VI.2.8 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN.104
VI.2.9 "SOUTHEM-BLOT".104
VI.2.10 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA
.105
VI.2.11 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR).105
VI.2.12 REVERSE TRANSKRIPTASE POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR).105
VI.2.13 HERSTELLUNG RADIOAKTIVER SONDEN.106
VI.2.13.1 DNA-MARKIERUNG DURCH "RANDOM PRIMING".106
VI.2 13.2 REINIGUNG RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-FRAGMENTE.106
VI.2.14 KLONIERUNG VON GENOMISCHEN UND CDNA SEQUENZEN MITTELS
PHAGEN-SCREENING.L06
VI.2.14.1 SCREENEN VON PHAGEN-BANKEN.106
VI.2.14.2 ISOLIERUNG VON PHAGEN-DNA.107
VI.2.15 EXTRAKTION UND REINIGUNG VON RNA.107
VI.2.15.1 RNA-ISOLATION AUS ZELLEN UND GEWEBEN DURCH SAURE EXTRAKTION
MIT GITC.108
VI.2.15.2 ANREICHERUNG VON POLY(A) RNA.108
VI.2.16 GELELEKTROPHORESE VON RNA UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN.108
VI.2.17 "NORTHEM-BLOT".109
VI.2.18 FILTERHYBRIDISIERUNG.109
VI.2.19 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE.109
VI.2.20 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.HO
VI.2.20.1 SDS-POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE.110
VI.2.20.2 WESTERN BLOT.HO
VI.2.20.3 PROTEINDETEKTION AUFWESTEM-BLOT.110
VI.2.20.4IN VITRO TRANSLATION.HL
VI.2.20.5 PROTEINBESTIMMUNG
.111
VI.2.21 ZELLKULTUR-METHODEN.112
VI.2.21.1 KULTIVIERUNG VON EUKARYONTISCHEN ZELLEN.112
VI.2.21.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON ZELLKULTUREN.112
VI.2.21.3 X-GAL-FAERBUNG TRANSFIZIERTER ZELLKULTUREN.112
VI.2.21.4 KULTIVIERUNG VON EMBRYONALEN STAMMZELLEN.112
VI.2.21.5 KULTIVIERUNG VON EMBRYONALEN FEEDERZELLEN.113
VI.2.21.6 ELEKTROPORATION DER ES-ZELLEN MIT "KNOCKOUT" VEKTOREN.113
VI.2.21.7 SELEKTION DER NEOMYZINRESISTENTEN ES-ZELLKLONE.114
VI.2.21.8 DNA-ISOLIERUNG UND RESTRIKTIONSVERDAU VON ES-ZELLEN.114
VI.2.22 INJEKTION UND TRANSFER VON ES-ZELLEN IN TAG 3,5
MAUSBLASTOZYSTEN.114
VI.2.23 DNA-ISOLIERUNG AUS DER SCHWANZSPITZE VON MAEUSEN.114
VI.2.24 DNA-ISOLIERUNG AUS DEM DOTTERSACK VON MAUSEMBRYONEN.115
VL.2.25 X-GAEL-FAERBUNG VON EMBRYONEN UND GEWEBEN.115
VI.2.26 SERUMGEWINNUNG.115
VI.2.27 BESTIMMUNG DER CALCIUM-KONZENTRATION IM SERUM UND URIN.116
VI.2.28 BESTIMMUNG DER 1,25-OH-VITD- UND PTH-KONZENTRATION IM
MAEUSESERUM.116
VI. 2.29 HERSTELLUNG VON SKELETTPRAEPARATIONEN.116
VI.2.30 "WHOLE MOUNT" IMMUNHISTOLOGIE AN MAUSEMBRYONEN
.116
VI.2.31 HISTOLOGISCHE NACHWEISMETHODEN AN PARAFFINSCHNITTEN.117
VI.2.31.1 HERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN VON MAUS EMBRYONAL.117
VI.2.31.2 HE- UND GIEMSA-FAERBUNG. 117
VI.2.31.3 PAS-FAERBUNG
.117
VI.2.31.4 IMMUNHISTOLOGIE AN PARAFFINSCHNITTEN.118
VI. 2.31.5 LEKTIN-FAERBUNGEN.118
VI. 2.32 IN SITU HYBRIDISIERUNG AN PARAFFINSCHNITTEN
.119
VI.2.32.1 HERSTELLUNG DER RNA-SONDENSSR DIE ISH MITTELS IN VITRO
TRANSKRIPTION
.119
VI.2.32.2 IN SITU HYBRIDISIERUNG AN SCHNITTEN VON MAUSEMBRYONEN.119
VL.2.33 NACHWEIS APOPTOTISCHER ZELLEN.120
VI.2.33.1 TUNEL-ASSAY.120
VI.2.33.2 NACHWEISPYKNOTISCHER ZELLEN MIT PROPIDIUMIODID-FAERBUNG.120
VI.2.34 ANALYSE DER ZELLPROLIFERATION DURCH BRDU-EINBAU.120
VH LITERATURVERZEICHNIS.122
VIN ABKUERZUNGEN.137
IX ANHANG: AP-2 SEQUENZEN.140
X LEBENSLAUF UND SCHRIFTENVERZEICHNIS.142
XI DANKSAGUNGEN
145 |
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