Regulation der Typ I und Typ II Adenylylcyclase durch Beta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
L
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1
1
EINLEITUNG
3
1.1
G-PROTEIN-VERMITTELTE
SIGNALTRANSDUKTION
4
1.1.1
AUFBAU
UND
FUNKTION
HETEROTRIMERER
G-PROTEINE
4
1.1.2
G-PROTEIN-A-UNTEREINHEITEN
5
1.1.3
G-PROTEIN-SS-UND
^-UNTEREINHEITEN
7
1.1.4
GSSY-EFFEKTOREN
10
1.2
ADENYLYLCYCLASEN
11
1.2.1
ADENYLYLCYCLASE-ISOFORMEN
12
1.2.2
STRUKTUR
VON
PARTIKULAEREN
SAEUGER-ADENYLYLCYCLASEN
13
1.2.3
DAS
KATALYTISCHE
ZENTRUM
15
1.2.4
REGULATOREN
PARTIKULAERER
SAEUGER-ADENYLYLCYCLASEN
17
1.2.4.1
FORSKOLIN
17
1.2.4.2
CA
2
*-CALMODULIN
17
1.2.4.3
G-PROTEIN-A-UNTEREINHEITEN
17
1.2.4.4
G-PROTEIN-SSY-UNTEREINHEITEN
18
2
ZIELSETZUNG
20
3
MATERIAL
21
3.1
HERSTELLER
UND
LIEFERANTEN
21
3.2
CHEMIKALIEN
21
3.3
ENZYME.
PROTEINE
UND
PEPTIDE
22
3.4
VEKTOREN
UND
KONSTRUKTE
23
3.5
OLIGONUKLEOTIDE
24
3.6
NUKLEOSIDPHOSPHATE
26
3.7
MOLEKULARGEWICHTSTANDARDS
26
3.8
REINIGUNGS
UND
TRENNMATERIALIEN
26
3.9
MEMBRANEN,
FILTER
UND
FILMMATERIAL
26
3.10
ZELLEN,
ZELLKULTURMEDIEN
UND
ZUSAETZE
26
3.11
PUFFER
UND
LOESUNGEN
27
4
METHODEN
28
4.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDMETHODEN
28
4.1.1
PRAEPARATION
CHEMISCH
KOMPETENTER
E.
CO/A-ZELLEN
28
4.1.2
TRANSFORMATION
VON
E
CO/I-ZELLEN
28
4.1.3
PLASMIDISOLATION
AUS
E
CO//-ZELLEN
29
4.1.4
SEQUENZSPEZIFISCHES
SCHNEIDEN
DOPPELSTRAENGIGER DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
29
4.1.5
PHENOLEXTRAKTION
VON
DNA
30
4.1.6
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
30
4.1.7
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
30
4.1.8
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
31
4.1.9
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
31
INHALTSVERZEICHNIS
II
4.1.10
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
31
4.1.11
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
31
4.2
PROTEINBIOCHEMISCHE
STANDARDMETHODEN
32
4.2.1
PROTEIN-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
32
4.2.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
32
4.2.3
COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG
33
4.2.4
ELEKTROPHORETISCHER
TRANSFER
VON
PROTEINEN
33
4.2.5
IMMUNOBLOT
33
4.3
PROKARYOTISCHE
PROTEIN-EXPRESSION
34
4.3.1
EXPRESSION
IN
E.
CO//-ZELLEN
34
4.3.2
PRAEPARATION
ZELLFREIER
LOESLICHER
FRAKTIONEN
VON
E.
CO/A-ZELLEN
34
4.4
EUKARYOTISCHE
PROTEIN-EXPRESSION
35
4.4.1
KULTIVIERUNG
VON
SF9-ZELLEN
35
4.4.2
KONSTRUKTION
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
35
4.4.3
AMPLIFIKATION
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
36
4.4.4
VIRUSINFEKTION
VON
SF9-ZELLEN
36
4.4.5
MEMBRANPRAEPARATION
VON
VIRUSINFIZIERTEN
SF9-ZELLEN
36
4.5
REINIGUNG
HETEROTRIMERER
G-PROTEINE
37
4.5.1
REINIGUNG
VON
GA,Q213L
37
4.5.2
REINIGUNG
VON
GSSRYJ
38
4.6
FUNKTIONSUNTERSUCHUNGEN
DER
ADENYLYLCYCLASE
40
4.6.1
BESTIMMUNG
DER
ADENYLYLCYCLASE-AKTIVITAET
40
4.6.2
INTERAKTIONSSTUDIEN
VON
ADENYLYLCYCLASEN
MIT
GSSTY
2
41
4.7
GENERIERUNG
VON
ADENYLYLCYCLASE-KONSTRUKTEN
UND
-MUTANTEN
42
4.7.1
GENERIERUNG
LOESLICHER
ADENYLYLCYCLASEN
42
4.7.2
GENERIERUNG
UND
MUTAGENESE
PARTIKULAERER
ADENYLYLCYCLASEN
44
4.7.2.1
LL-M1C1A
44
4.7.2.2
ACII-MUTANTEN
ACII-I
QEHA
UND
ACII-UI
QEH
A
44
4.7.2.3
ACI-MUTANTE
ACI-II
C
I
QE
HA
46
4.7.3
GENERIERUNG
DER
GA,-MUTANTE
GASQ213L
46
5
ERGEBNISSE
47
5.1
FUNKTIONELLE
DOMAENEN
DER
TYP
I
ADENYLYLCYCLASE
47
5.1.1
INTERAKTION
VON
CYTOSOLISCHEN
ACI-DOMAENEN
MIT
GSSY
47
5.1.2
EINFLUSS
DER
CIQEHA-REGION
AUF
DIE
GSSY-REGULATION
52
5.1.2.1
REGULATION
DER
MUTANTE
ACI-II
CIQEHA
54
5.1.2.2
KOENNEN
CIQEHA-PEPTIDE
DER
ACI
UND
ACH
MIT
ADENYLYLCYCLASEN
AM
GSSY
KONKURRIEREN?
57
5.2
FUNKTIONELLE
DOMAENEN
DER
TYP
II
ADENYLYLCYCLASE
59
5.2.1
EINFLUSS
DER
QEHA-REGION
AUF
DIE
GSSY-REGULATION
59
5.2.1.1
REGULATION
DER
MUTANTEN
ACII-I
Q
E
HA
UND
ACII-III
Q
E
HA
59
5.2.1.2
KOENNEN
QEHA-PEPTIDE
DER
ACI
UND
ACIII
MIT
ADENYLYLCYCLASEN
AM
GSSY
KONKURRIEREN?
63
5.2.2
EINFLUSS
DER
M2
UND
C2-DOMAENE
AUF
DIE
GSSY-REGULATION
65
5.2.2.1
KONSTRUKTION
UND
EXPRESSION
VON
ACI-ACII-CHIMAEREN
65
5.2.2.2
REGULATION
DER
ACI-ACII-CHIMAEREN
68
INHALTSVERZEICHNIS
UL
5.2.3
INTERAKTION
VON
CYTOSOLISCHEN
ACII-DOMAENEN
MIT
GSSY
71
5.2.4
EINFLUSS
DER
C1-DOMAENE
AUF
DIE
GSSY-REGULATION
76
5.2.4.1
KONSTRUKTION
UND
EXPRESSION
EINER
C1B-DELETIONSMUTANTE
DER
ACH
76
5.2.4.2
REGULATION
DER
C1B-DELETIONSMUTANTE
79
OE.2.4.3
KANN
DAS
PEPTID
MRAS
MIT
ADENYLYLCYCLASEN
AM
GSSY
KONKURRIEREN?
83
6
DISKUSSION
86
6.1
DIE
QEHA-REGION
ALS
MODUL
86
6.1.1
EINFLUSS
DER
C1
QEHA-REGION
AUF
DIE
GSSY-REGULATION
DER
TYP
I
ADENYLYLCYCLASE
86
6.1.2
DIE
QEHA-REGION
ALS
GSSY-BINDENDE
DETERMINANTE
DER
TYP
I
UND
TYP
II
ADENYLYLCYCLASE
89
6.2
GSSY-REGULATION
VON
ACI-ACII-CHIMAEREN
91
6.3
DIE
CYTOSOLISCHEN
DOMAENEN
ALS
DETERMINANTEN
FUER
DIE
GSSY-REGULATION
94
6.4
GSSY-INTERAKTION
MIT
DER
ADENYLYLCYCLASE:
TERTIAER
UND
MOEGLICHE
QUARTAERSTRUKTUR
97
7
ZUSAMMENFASSUNG
100
8
LITERATURVERZEICHNIS
102
ANHANG
EIGENE
PUBLIKATIONEN
LEBENSLAUF
DANKSAGUNG |
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