Bestimmung der Affinität und Aktivität subtypselektiver Histamin- und Neuropeptid-Y-Rezeptorliganden an konventionellen und neuen pharmakologischen In-vitro-Modellen: Untersuchung von Enantiomeren, Racematen und fluoreszenten Substanzen an isolierten Organen und zellulären Testsystemen
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2001
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BESTIMMUNG DER AFFINITAET UND AKTIVITAET
SUBTYPSELEKTIVER HISTAMIN- UND NEUROPEPTID Y-REZEPTORLIGANDEN AN
KONVENTIONELLEN UND NEUEN PHARMAKOLOGISCHEN IN-VITRO-MODELLEN
UNTERSUCHUNG VON ENANTIOMEREN, RACEMATEN UND FLUORESZENTEN SUBSTANZEN AN
ISOLIERTEN ORGANEN UND ZELLULAEREN TESTSYSTEMEN
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET IV - CHEMIE UND PHARMAZIE -
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON JULIA KRACHT AUS LUEBBECKE-NETTELSTEDT 2001
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 HISTAMIN 1
1.1.1 HISTAMIN HI-REZEPTOR 3
1.1.2 HISTAMIN H 2 -REZEPTOR 5
1.1.3 HISTAMIN H 3 -REZEPTOR 8
1.1.4 HISTAMIN H»-REZEPTOR 9
1.2 NEUROPEPTID Y (NPY).. .... ..... ... ... ..... ..... .. .. ... . ...
.... 10
1.Z1 NPY YI-REZEPTOR *..: 13
1.2.2 NPY Y 2 -REZEPTOR 17
1.2.3 NPY Y 3 -REZEPTOR 18
1.2.4 NPY Y*-REZEPTOR 19
1.2.5 NPY YS-REZEPTOR 20
1.2.6 NPY Y 6 -REZEPTOR 21
13 VERGLEICHBARKEIT FTANKTIONELLER DATEN AUS UNTERSCHIEDLICHEN
TESTSYSTEMEN...... ..... 22
1.3.1 SUBSTANZSPEZIFISCHE EIGENSCHAFTEN 22
1.3.2 VON LIGAND UND TESTSYSTEM BESTIMMTE PARAMETER 22
1.3.2.1 *EFFICACY (RELATIVE REIZAKTIVITAET) 22
1.3.2.2 *INTRINSIC ACTIVITY (INTRINSISCHE WIRKAKTIVITAET A) 23
1.3.2.3 POTENZ EINER VERBINDUNG 23
1.3.2.4 REZEPTORRESERVE (*SPARE RECEPTORS ) 23
1.3.3 CHARAKTERISIERUNG VON AGONISTEN 25
1.3.4 CHARAKTERISIERUNG VON KOMPETITIVEN ANTAGONISTEN 27
2 ZIELSETZUNG ... .... ...... ..... ....... ..... ...... 29
3 ERGEBNISSE UND
DISKUSSION..................................................................................
30
3.1 RADIOLIGAND-BINDUNGSVERSUCHE AM HISTAMIN HI-REZEPTOR 30
3.1.1 AUSWAHL VON ZELLLINIE UND RADIOLIGAND 30
3.1.2 BINDUNGSVERSUCHE AN INTAKTEN ZELLEN 31
3.1.2.1 ERMITTLUNG DER VERSUCHSPARAMETER . 31
I
IMAGE 3
3.1.2.1.1 RADIOLIGANDKONZENTRATION 31
3.1.2.1.2 ASSOZIATIONSKINETIK 31
3.1.2.1.3 KOMPETITIONSEXPERIMENT 32
3.1.3 BINDUNGSVERSUCHE AN ZELLMEMBRANEN 37
3.1.3.1 BINDUNGSVERSUCHE MIT CHO-HI-18-MEMBRANEN 37
3.1.3.2 BINDUNGSVERSUCHE MIT U-373 MG-MEMBRANEN 40
3.1.3.3 BINDUNGSVERSUCHE MIT CHO-KI-HI-MEMBRANEN 42
3.2 PHARMAKOLOGISCHE TESTUNG FLUORESZENZMARKIERTER HISTAMIN
HI-ANTAGONISTEN ....46
3.2.1 UNTERSUCHUNGEN AM ISOLIERTEN MEERSCHWEINCHEN-ILEUM 46
3.2.1.1 OPTIMIERUNG DER VERSUCHSBEDINGUNGEN 46
3.2.1.2 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNGEN AM MEERSCHWEINCHEN-ILEUM 49
3.2.2 UNTERSUCHUNGEN IM CA 2+ -ASSAY 53
3.2.2.1 AUSWAHL DER ZELLLINIE 53
3.2.2.2 UEBERPRUEFUNG DES TESTMODELLS MIT HI-REZEPTOR ANTAGONISTEN 55
3.2.2.3 UEBERPRUEFUNG DES TESTMODELLS MIT HI-REZEPTOR-AGONISTEN 60
3.2.2.4 AMINOSAEURESEQUENZ DES HI-REZEPTORS DER U-373 MG-ZELLEN 63
3.2.2.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR REZEPTORRESERVE 64
3.2.2.6 ERGEBNISSE DER TESTUNG VON FLUORESZENZMARKIERTEN H R
ANTAGONISTEN IM CA 2+ - ASSAY - VERGLEICH MIT AM MEERSCHWEINCHEN-ILEUM
ERMITTELTEN DATEN 67
33 RADIOLIGAND-BINDUNGSVERSUCHE AM HISTAMIN H 2 -REZEPTOR ...... 70
3.3.1 AUSWAHL VON ZELLLINIE UND RADIOLIGAND 70
3.3.2 BINDUNGSVERSUCHE MIT MKN-45-ZELLEN 71
3.4 ERGEBNISSE DER PHARMAKOLOGISCHEN UNTERSUCHUNG NEUER HISTAMIN H 2
-REZEPTOR- AGONISTEN 74
3.4.1 FUNKTIONELLE PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG NEUER
ARPROMIDIN-ANALOGA AN
VERSCHIEDENEN HISTAMINREZEPTORMODELLEN 74
3.4.2 PHARMAKOLOGISCHE UNTERSCHIEDE ZWISCHEN STEREOISOMEREN
ARPROMIDIN-ANALOGA 80
3.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR SPEZIES-SPEZIFISCHEN WIRKUNG VON
ARPROMIDIN-ANALOGA.... 82
3.5.1 VERSUCHE AN DER ISOLIERT PERFUNDIERTEN RATTENNIERE 85
3.5.2 BESTIMMUNG DER H2-AGONISTISCHEN WIRKUNG IM CAMP-ASSAY 89
3.5.2.1 OPTIMIERUNG DER VERSUCHSBEDINGUNGEN 90
II
3.5.2.2 UEBERPRUEFUNG DES TESTMODELLS DURCH HISTAMIN UND H 2 -AGONISTEN 91
3.5.2.3 UEBERPRUEFUNG DES TESTMODELLS DURCH H 2 -ANTAGONISTEN 93
3.5.2.4 UNTERSUCHUNG VON ARPROMIDIN-ANALOGA IM CAMP-ASSAY 94
3.6 EXPRESSION DES NEUROPEPTID Y Y 2 -REZEPTORS ......-.. ... 6
3.6.1 KLONIERUNG DER NPY Y 2 -DNA AUS DEM PCDNA3- IN DEN PCDEF3-VEKTOR
97 _
3.6.2 ZELLLINIE UND TRANSFEKTIONSMETHODE 98
3.7 EXPRESSION DES NEUROPEPTID Y Y 4 -REZEPTORS 100
3.7.1 RADIOLIGANDBINDUNGSVERSUCHE AN HEC-1-B-Y 4 -KLONEN 101
3.7.1.1 BINDUNGSVERSUCHE MIT [ 125 I]-HPYY ALS RADIOLIGAND 101
3.7.1.2 BINDUNGSVERSUCHE MIT [ 125 I]-HPP ALS RADIOLIGAND 103
3.8 ERGEBNISSE DER PHARMAKOLOGISCHEN UNTERSUCHUNG NEUER NEUROPEPTID
Y-REZEPTOR- LICANDEN
...**..**..**..»*.....**............*......**. ******...*** *** **** *** **** * ** ** * ** *
1^
3.8.1 UNTERSUCHUNG DES BISGUANIDINS SK-48 AM DUCTUS DEFERENS (Y 2
-REZEPTORMODELL) 106
3.8.2 NEUROPEPTID Y YI-ANTAGONISTEN HO
3.8.2.1 ARGININAMIDE MIT AKZEPTOR-SUBSTITUIERTEN GUANIDINO-GRUPPEN 112
3.8.2.2 ARGININAMIDE MIT HALOGENIERTEN N -DIPHENYLACETYL-SUBSTITUENTEN
114
3.8.2.3 KORRELATION DER ERGEBNISSE AUS CA 2+ -ASSAY UND
RADIOLIGAND-BINDUNGSSTUDIEN 115
3.8.2.4 UNTERSUCHUNGEN IM CAMP-ASSAY 117
3.8.2.5 REZEPTORSUBTYPSELEKTIVITAET DER ARGININAMIDE 118
3.8.3 ERGEBNISSE DER UNTERSUCHUNGEN AM Y 5 -REZEPTORMODELL 120
4 ZUSAMMENFASSUNG. 122
5 EXPERIMENTELLER TEIL 125
5.1 ALLGEMEINES 125
5.1.1 PHARMAKOLOGISCHE KENNGROESSEN 125
5.1.2 SOFTWARE 1 26
5.1.3 GERAETE 1 26
5.1.4 VERBRAUCHSMATERIALIEN 127
5.1.5 SUBSTANZEN, ENZYME UND TESTKITS 127
5.1.6 VERSUCHSTIERE 1 30
5.2 ORGANPHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN .. ... *** ***** I 30
III
IMAGE 4
5.2.1 ELEKTROLYTLOESUNGEN 130
5.2.2 DAS ISOLIERTE MEERSCHWEINCHEN-ILEUM ALS HI-REZEPTORMODELL 132
5.2.2.1 ORGANBAD 132
5.2.2.2 ORGANPRAEPARATION 132
5.2.2.3 VERSUCHSABLAUF 132
5.2.3 DAS ISOLIERTE ATRIUM DEXTRUM DES MEERSCHWEINCHENS ALS
H2-REZEPTOR-MODELL 133
5.2.3.1 ORGANBAD 133
5.2.3.2 ORGANPRAEPARATION 133
5.2.3.3 VERSUCHSABLAUF 133
5.2.4 DIE ISOLIERTE ILEUMMUSKULATUR ALS H3-REZEPTORMODELL 134
5.2.4.1 ORGANBAD 134
5.2.4.2 ORGANPRAEPARATION 134
5.2.4.3 VERSUCHSABLAUF 134
5.2.5 DER ISOLIERTE DUCTUS DEFERENS DER RATTE ALS NPY Y2-REZEPTORMODELL
135
5.2.5.1 ORGANBAD 135
5.2.5.2 ORGANPRAEPARATION 135
5.2.5.3 VERSUCHSABLAUF 135
5.2.6 DIE ISOLIERT PERFUNDIERTE RATTENNIERE ALS HISTAMIN
H2-REZEPTORMODELL 136
5.2.6.1 APPARATUR 136
5.2.6.2 ZUSAMMENSETZUNG VON DIALYSAT UND PERFUSAT 136
5.2.6.3 ORGANPRAEPARATION UND VERSUCHSABLAUF 137
C ? 7^ III?ULIUR 138
5.3.1 REAGENZIEN 138
5.3.2 ZELLLINIEN 138
5.3.3 KULTURBEDINGUNGEN 140
5.3.4 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 140
5.3.5 DIALYSE VON FCS 140
5.4 ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN 3 ,5 -CAMP-KONZENTRATION
................... 141
5.4.1 REAGENZIEN 141
5.4.2 STIMULATION DER ZELLEN 143
5.4.2.1 TESTUNG VON HISTAMIN-REZEPTORLIGANDEN 143
5.4.2.2 TESTUNG VON NPY-ANTAGONISTEN 144
5.4.3 PROBENAUFBEREITUNG 145
IV
5.4.4 ENZYMATISCHE UMSETZUNG 145
5.4.4.1 PRINZIP 145
5.4.4.2 DURCHFUEHRUNG 147
5.4.5 GERAETEEINSTELLUNGEN 148
5.4.6 BERECHNUNG DES CAMP-GEHALTES 148
5.5 ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN CA 2+ -KONZENTRATION ......
. .. 149
5.5.1 REAGENZIEN 149
5.5.2 GERAETEEINSTELLUNGEN 150
5.5.3 VORBEREITUNG DER ZELLEN 150
5.5.4 KALIBRIERUNG UND BERECHNUNG DES [CA 2+ ]J-ANSTIEGS 151
5.5.5 AUFNAHME VON KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVEN 151
5.5.6 TESTUNG VON HISTAMIN HI-REZEPTORANTAGONISTEN 152
5.5.7 SCREENING VON NPY-ANTAGONISTEN 152
5.6 RADIOLIGAND-BINDUNGSASSAY -..........-. ..... . . . ..153
5.6.1 REAGENZIEN 153
5.6.2 BINDUNGSASSAY AN INTAKTEN ZELLEN 155
5.6.2.1 VORBEREITUNG DER ZELLEN 155
5.6.2.2 DURCHFUEHRUNG DES BINDUNGSASSAYS 155
5.6.3 MEMBRANPRAEPARATION 156
5.6.3.1 METHODE 1 157
5.6.3.2 METHODE II 157
5.6.3.3 METHODE M 158
5.6.3.4 METHODE IV 158
5.6.4 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 158
5.6.5 Y 2 -BINDUNGSASSAY AN SMS-KAN-MEMBRANEN 159
5.6.5.1 VORBEREITUNG 159
5.6.5.2 INKUBATION 159
5.6.5.3 ABTRENNUNG DES RADIOLIGANDEN 160
5.6.6 BINDUNGSVERSUCHE AN MEMBRANEN VON HEC-1-B-Y 4 -KLONEN 160
5.6.7 BINDUNGSVERSUCHE AN ZELLMEMBRANEN MIT HISTAMIN-REZEPTOREN 160
5.6.7.1 VORBEREITUNG 160
5.6.7.2 INKUBATION 160
5.6.7.3 ABTRENNUNG DES RADIOLIGANDEN 161
V
IMAGE 5
5.7 TRANSFEKTIONSEXPCRIMENTE ........-.... .... ... ..... .....
......-......162
5.7.1 BAKTERIENMEDIEN UND REAGENZIEN 162
5.7.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER .CO/I-ZELLEN 163
5.7.3 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN .CO/I-ZELLEN 163
5.7.4 PLASMID-DNA PRAEPARATION 163
5.7.4.1 ISOLIERUNG VON DNA DURCH ALKALISCHE SCHNELL-LYSE (MINIPREP) 164
5.7.4.2 ISOLIERUNG VON DNA UEBER QIAGEN-SAEULEN (MAXIPREP) 164
5.7.5 DNA KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNGEN 165
5.7.6 RESTRIKTIONSVERDAU 165
5.7.7 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 166
5.7.8 SEQUENZIERUNG DER CDNA AUS U-373 MG ZELLEN 166
5.7.8.1 RNA-ISOLIERUNG 166
5.7.8.2 REVERSE TRANSKRIPTION 167
5.7.8.3 PCR DES HISTAMIN HJ-REZEPTORS DER U-373 MG-ZELLEN 167
5.7.8.4 AMPLIFIZIERUNG DER PCR-PRODUKTE 169
5.7.9 KLONIERUNG DER NPY Y 2 -REZEPTOR-DNA AUS DEM PCDNA3- IN DEN PCDEF3
VEKTORL70
5.7.10 TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE 172
5.7.10.1 TRANSIENTE TRANSFEKTION 172
5.7.10.2 STABILE TRANSFEKTION 172
5.8 AUSWERTUNG DER EXPERIMENTELLEN DATEN ...... ... ...... ........
........ ....172
5.8.1 BERECHNUNG VON EC50-WERTEN AUS KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVEN 172
5.8.2 BERECHNUNG VON IC 50 -WERTEN 173
5.8.2.1 BERECHNUNG VON IC50-WERTEN AUS KOMPETITIONSKURVEN 173
5.8.2.2 BERECHNUNG VON IQO-WERTEN MITTELS LOGH-TRANFORMATION 173
5.8.3 BERECHNUNG VON K;-WERTEN 174
5.8.4 BESTIMMUNG VON PKSS-WERTEN 174
5.8.4.1 BESTIMMUNG VON PK B -WERTEN MIT HILFE DES SCHILD-PLOTS 174
5.8.4.2 BESTIMMUNG VON PKSS-WERTEN MIT HILFE DER CHENG-PRUSOFF-GLEICHUNG
175
6 LITERATURVERZEICHNIS ........ ..... ..... ...... ..... .....
........176
VI
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| spelling | Kracht, Julia Verfasser aut Bestimmung der Affinität und Aktivität subtypselektiver Histamin- und Neuropeptid-Y-Rezeptorliganden an konventionellen und neuen pharmakologischen In-vitro-Modellen Untersuchung von Enantiomeren, Racematen und fluoreszenten Substanzen an isolierten Organen und zellulären Testsystemen vorgelegt von Julia Kracht 2001 VI, 191 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2001 In vitro (DE-588)4250701-7 gnd rswk-swf Ligand Biochemie (DE-588)4606532-5 gnd rswk-swf Chemische Affinität (DE-588)4132311-7 gnd rswk-swf Neuropeptid Y (DE-588)4317370-6 gnd rswk-swf Histaminrezeptor (DE-588)4257968-5 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Histaminrezeptor (DE-588)4257968-5 s Ligand Biochemie (DE-588)4606532-5 s Chemische Affinität (DE-588)4132311-7 s In vitro (DE-588)4250701-7 s DE-604 Neuropeptid Y (DE-588)4317370-6 s GBV Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009536098&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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