Tumornekrosefaktor-(TNF)-alpha-induzierte Barrierestörung an menschlichen Colonzellen (HT-29/B6): Lokalisierung mittels Conductance scanning
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
.
6
2
EINLEITUNG
.
8
2.1
DIE
EPITHELIALE
BARRIEREFUNKTION
.
8
2.1.1
SCHLUSSLEISTEN
.
8
2.1.2
LECKE
UND
DICHTE
EPITHELIEN
.
10
2.1.3
CONDUCTANCE
SCANNING
.
11
2.2 BARRIERESTOERUNGEN
UND
IHRE
PATHOPHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
.
12
2.3
TNF-A
.
13
2.4
PROGRAMMIERTER
ZELLTOD
DURCH
APOPTOSE
.
15
2.4.1
APOPTOSE
.
15
2.4.2
APOPTOSE
IN
EPITHELZELLEN
.
16
2.5
ZIELE
DER
ARBEIT
.
17
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
18
3.1
HT-29/B6-ZELLEN
.
18
3.2
KULTURBEDINGUNGEN
.
18
3.3 LOESUNGEN
UND
TESTSUBSTANZEN
.
19
3.4
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
VORVERSUCHE
.
21
3.4.1
VERLAUFSKONTROLLE
DES
TRANSEPITHELIALEN
WIDERSTANDES
.
21
3.4.2
USSING-EXPERIMENTE
.
21
3.4.3
IMPEDANZANALYSE
.
22
3.5
CONDUCTANCE
SCANNING
.
23
3.5.1
THEORETISCHE
GRUNDLAGEN
.
23
3.5.1.1
APPARENTE
LEITFAEHIGKEIT
.
24
3.5.1.2
TRANS
UND
PARAZELLULAERE
LEITFAEHIGKEIT
.
24
3.5.2
VERSUCHSAUFBAU
.
28
3.6
VERSUCHSABLAEUFE
.
34
3.6.1
METHODENEVALUIERUNG
.
34
3.6.2
DISKRIMINIERUNG
TRANS
UND
PARAZELLULAERER
LEITFAEHIGKEITEN
.
34
3.6.3
TNF-A-INDUZIERTE
BARRIERESTOERUNG
.
35
3.6.4
HEMMUNG
DER
BARRIERESTOERUNG
MIT
Z-VAD.FMK
.
36
3.7
STATISTIK
.
37
3.8
HISTOLOGIE
.
38
3.8.1
GEWEBEPRAEPARATION
.
39
3.8.2
APOPTOSENACHWEISE
.
41
3.8.2.1
HAEMATOXYLIN-EOSIN
(HE-)
FAERBUNG
.
41
3.8.2.2
TUNEL-REAKTION
.
42
3.8.2.3
DAPL-KEMFAERBUNG
.
43
3.8.2.4
OCCLUDINFAERBUNG
.
44
3.8.2.5
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
45
3.8.2.6
APOPTOSEN
IM
LEBENDEN
MONOLAYER
.
45
4
EVALUIERUNG
DER
METHODE
.
46
4.1
KLEMMSTROM
.
46
4.2
ZELLKULTURFILTER
UND
KAMMERABDICHTUNG
.
48
4.3
LEITFAEHIGKEITSAENDERUNGEN
DURCH
ARTEFAKTE
.
49
4.4
MORPHOLOGIE
DER
HT-29/B6-ZELLEN
.
50
4.5
VIABILITAET
DER
HT-29/B6-ZELLEN
.
51
4.6 FLAECHENDICHTE
DER
HT-29/B6-ZELLEN
.
51
4.7 KERN-PLASMA-RELATION
(NEKROSEAUSSCHLUSS)
.
52
4.8 EFFEKT
EINER
EXTRAZELLULAEREN
CA
2+
-REDUZIERUNG
AUF
DEN
R'
.
54
5
ERGEBNISSE
.
57
5.1
DIFFERENZIERUNG
TRANS
UND
PARAZELLULAERER
LEITFAEHIGKEITEN
.
57
5.1.1
TRANSEPITHELIALE
WIDERSTAENDE
.
57
5.1.2
APPARENTE
LEITFAEHIGKEITEN
.
58
5.1.3
LOKALE
TRANS
UND
PARAZELLULAERE
LEITFAEHIGKEITEN
.
59
5.1.4
HETEROGENITAET
DER
PARAZELLULAEREN
LEITFAEHIGKEIT
.
60
5.2
APOPTOSEN
IM
HT-29/B6-EPITHEL
.
62
5.2.1
LEBENDE
UNBEHANDELTE
EPITHELIEN
.
62
5.2.1.1
APOPTOSESTADIEN
.
64
5.2.2
DUENNSCHNITTE
(HE-FAERBUNG)
.
66
5.2.3
SEMIDUENNSCHNITTE
(RICHARDSON-FAERBUNG)
.
66
5.2.4
PARAFFINSCHNITTE
(DAPI-,
TUNEL-IMMUNFLUORESZENZ)
.
68
5.2.5
INTAKTE
MONOLAYER
(OCCLUDIN-IMMUNFLUORESZENZ)
.
69
5.2.6
ULTRADUENNSCHNITTE
(ELEKTRONENMIKROSKOPIE)
.
70
5.3 QUANTIFIZIERUNG
DER
APOPTOSE
.
72
5.4
DIE
BARRIEREFUNKTION
DES
HT-29/B6-EPITHELS
.
73
5.4.1
ZEITVERLAUF
DER
TNF-A-INDUZIERTEN
BARRIERESTOERUNG
.
73
5.4.2
LEITFAEHIGKEITSAENDERUNGEN
AN
APOPTOSEN
.
74
5.4.3
HAEUFIGKEITSVERTEILUNG
DER
LEITWERTE
EINZELNER
APOPTOSEN
.
75
5.4.4
QUANTIFIZIERUNG
DER
BARRIEREFUNKTIONSSTOERUNG
.
79
5.4.5
HEMMUNG
DER
BARRIERESTOERUNG
DURCH
Z-VAD.
FMK
.
81
5.4.5.1
EFFEKT
VON
Z-VAD.FMK
AUF
DEN
R'
.
81
5.4.5.2
APOPTOSEHAEUFIGKEIT
.
82
5.4.5.3
HAEUFIGKEITSVERTEILUNG
DER
LEITWERTE
.
82
5.4.5.4 APOPTOTISCHE
UND
NICHT-APOPTOTISCHE
LEITFAEHIGKEITEN
.
83
6
DISKUSSION
.
86
6.1
BEDEUTUNG
DER
EXTRAZELLULAEREN
KALZIUMKONZENTRATION
.
86
6.1.1
T
RANSEPITHELIALE
WIDERSTAENDE
.
87
6.1.2
TRANS
UND
PARAZELLULAERE
LEITFAEHIGKEITEN
.
88
6.1.3
HETEROGENITAET
DER
PARAZELLULAEREN
LEITFAEHIGKEIT
.
89
6.1.4
BEWERTUNG
DES
ZELLMODELLS
HT-29/B6
.
90
6.2 MORPHOLOGIE
DER
APOPTOSE
.
91
6.2.1
APOPTOSE
IM
COLONEPITHEL
.
91
6.2.2
ABWESENHEIT
VON
NEKROSE
IM
HT-29/B6-EPITHEL
.
93
6.2.3 VERGLEICH
DER
HISTOLOGISCHEN
APOPTOSENACHWEISE
.
96
6.2.4
BEWERTUNG
DER
NACHWEISE
FUER
DAS
HT-29/B6-MODELL
.
101
6.2.5
PHASEN
DER
APOPTOSE
.
102
6.2.6 QUANTIFIZIERUNG
SPONTANER
UND
TNF-A-INDUZIERTER
APOPTOSE
.
103
6.3
TNF-A-EFFEKTE
AUF
DIE
EPITHELIALE
BARRIERE
.
107
6.3.1
TNF-A-EFFEKTE
AUF
R'
.
107
6.3.2
APOPTOSE-ASSOZIIERTER
BARRIEREDEFEKT
.
112
6.3.3
EFFEKTE
DES
CASPASEINHIBITORS
Z-VAD.FMK
.
116
6.4
DIE
PATHOPHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DER
STUDIE
.
119
7
LITERATURLISTE
.
121
8
ANHANG
2 |
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