Der Übergang von der Latenz zur lytischen Replikation des Epstein-Barr-Virus: vergleichende Analysen zur Bedeutung regulatorischer HI-Motive im Promotor des viralen Gens BZLF-1
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER IM TEXT VERWENDETEN ABKUERZUNGEN_
ZUSAMMENFASSUNG
_
IV
EINLEITUNG
1.1 DIE FAMILIE DER HERPESVIREN
1.2 DAS EPSTEIN-BARR-VIRUS_
1.2.1 DIE ENTDECKUNG DES EPSTEIN-BARR-VIRUS
1
.
2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1
.
2.6
1.2.7
1
.
2.8
EBV-ASSOZIIERTE ERKRANKUNGEN
GENOMSTRUKTUR DES EPSTEIN-BARR-VIRUS
DER INFEKTIONSWEG VON EBV_
LATENTE INFEKTION UND IMMORTALISIERUNG VON B-ZELLEN
DIE LYTISCHE VERMEHRUNG DES EPSTEIN-BARR-VIRUS_
DAS BZLF-L-GEN
DIE REGULATION DES BZLF-L-GENS_
1.3 ZIELSETZUNG DER ARBEIT
MATERIAL UND METHODEN
2.1 AUSGANGSMATERIALIEN _
2.1.1 BAKTERIEN_
2
.
1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2
.
1.6
2.1.7
NAEHRMEDIEN FUER BAKTERIEN
VERWENDETE AUSGANGSPLASMIDE
ZELLINIEN
VERWENDETE ANTIKOERPER UND SEREN
VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE _
VERWENDETE EDV-PROGRAMME
2.2 ARBEITEN MIT BAKTERIEN_
2.2.1 ANZUCHT VON BAKTERIEN IM FERMENTER_
2.2.2 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN _
2.2.3 AUFBEWAHRUNG VON BAKTERIENKULTUREN
2.3 ARBEITEN MIT ZELLKULTUREN_
2.3.1 TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN_
2.3.2 NACHWEISSYSTEME FUER REPORTERPROTEINE_
2.3.3 CHEMISCHE INDUKTION DER LYTISCHEN REPLIKATION VON EBV_
2.3.4 AUFBEWAHRUNG VON ZELLKULTUREN_
VII
_1
1
2
2
3
7
9
_
10
_
15
16
.
18
23
25
.
25
_25
26
26
27
29
29
33
34
34
.34
.36
36
.36
38
.39
39
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.4 ARBEITEN MIT PROTEINEN_40
2.4.1 GEKOPPELTE
IN V/FRO-TRANSKRIPTION UND TRANSLATION (PROMEGA, MANNHEIM)_40
2.4.2 EXPRESSION VON ZTA-PROTEIN IN BAKTERIEN_40
2.4.3 ANALYSE VON PROTEINEN MITTELS
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE_41
2.4.4 WESTERN BLOT-ANALYSE_41
2.4.5 PROTEINMENGENBESTIMMUNG_ _42
2.4.6 GELRETARDATIONS-EXPERIMENTE (BANDSHIFT)_42
2.4.7 IMMUNFLUORESZENZ_45
2.5 ARBEITEN MIT DNA_45
2.5.1 ISOLIERUNG VON DNA_45
2.5.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN_47
2.5.3 RESTRIKTIONSENZYMVERDAU VON PLASMID-DNA_48
2.5.4 GELELEKTROPHORESE VON DNA_48
2.5.5 DNA-EXTRAKTION UND AUFREINIGUNG AUS AGAROSEGELEN_49
2.5.6 SOUTHERN BLOT_49
2.5.7 AMPLIFIKATION VON DNA MITTELS PCR (POLYMERASE-KETTEN-REAKTION) _
50
2.5.8 ZIELGERICHTETE
IN-VITRO MUTAGENESE MITTELS PCR (QUICKC 'HANGE SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
KIT
(STRATAGENE. HEIDELBERG)_ _ 51
2.5.9 SEQUENZIERUNG VON DNA _ _ _ 53
2.5.10 KLONIERUNGEN _ _ _ 54
2.6 ARBEITEN MIT RNA_55
2.6.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA MIT RNAZOL B _ 55
2.6.2 DENATURIERENDE GELELEKTROPHORESE_ _ _ 55
2.6.3 NORTHERN-BLOT-ANALYSE_56
2.6.4 PRIMER EXTENTION-EXPERIMENT_57
3 ERGEBNISSE_60
3.1 TRANSFEKTIONSSTUDIEN ZUR FUNKTION UND BEDEUTUNG DER HI-MOTIVE_60
3.1.1 UNTERSUCHUNGEN MIT KUENSTLICHEN MINIMALPROMOTOREN ZEIGTEN POSITIV-
UND NEGATIV-REGULATORISCHE
EIGENSCHAFTEN DER HI-MOTIV._ _61
3.1.2 IM KONTEXT DES ORIGINALPROMOTORS REPRIMIEREN DIE HL-MOTIVE DIE
BASALAKTIVITAET UND DIE
TRANSAKTIVIERUNG DURCH ZTA._64
3.1.3 IM KONTEXT DES ORIGINALGENS (BZLF-1-PROMOTOR UND -LESERAHMEN)
CO-STIMULIEREN DIE HL-MOTIVE
EINE TRANSAKTIVIERUNG DURCH ZTA._73
3.1.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR UNTERSCHIEDLICHEN FUNKTION DER HL-MOTIVE IN
ZWEI VERSCHIEDENEN
REPORTERSYSTEMEN._78
3.2 HERSTELLUNG REKOMBINANTER EPSTEIN-BARR VIREN_84
3.2.2 ERSTE UNTERSUCHUNGEN ZUR REPLIKATIONSKOMPETENZ DER REKOMBINANTEN
EBV-VARIANTEN. _ 92
94
4 DISKUSSION
INHALTSVERZEICHNIS
4.1 DIE BEDEUTUNG DES BZLF-L-GENS FUER DIE LYTISCHE VIRUSVERMEHRUNG UND
EXPERIMENTELLER
ANSATZ DER ARBEIT._94
4.2 DIE BEDEUTUNG DER HI-MOTIVE
IN VIVO
UND
IN VITRO
_95
4.3 REKOMBINANTE EPSTEIN-BARR-VIREN: DIE WIRKUNGSWEISE DER HI-MOTIVE IM
KONTEXT DES
GESAMTGENOMS VON EBV._103
ANHANG
_
105
5 LITERATURVERZEICHNIS
_115
DANKSAGUNG
_
138 |
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