Isolierung photorezeptorspezifisch exprimierter Gene: Klonierung und Charakterisierung der Ggamma-Untereinheit (Ggammae) des visuellen G-Proteins von Drosophila melanogaster
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2001
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I
NHALTSVERZEICHNIS
1
Z
USAMMENFASSUNG
1
2
E
INLEITUNG
3
2.1
A
NATOMIE
DES
K
OMPLEXAUGES
VON
D
ROSOPHILA
MELANOGASTER
3
2.2
D
IE
VISUELLE
S
IGNALTRANSDUKTION
IM
F
LIEGENAUGE
4
23
H
ETEROTRIMERE
G-P
ROTEINE
5
2.4
D
IE
G
Q
-U
NTEREINHEIT
7
2.5
DER
SSY-KOMPLEX
9
2.6
L
IPIDMODIFIKATIONEN
HETEROTRIMERER
G-P
ROTEINE
10
2.6.1
LIPIDMODIFIKATIONEN
DER
GA-UNTEREINHEIT
10
2.6.2
LIPIDMODIFIKATIONEN
DER
GY-UNTEREINHEIT
11
2.7
D
AS
VISUELLE
G-P
ROTEIN
VON
D
ROSOPHILA
13
2.8
P
ROBLEMSTELLUNG
15
3
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
17
3.1
M
ATERIAL
17
3.1.1
CHEMIKALIEN,
VERBRAUCHSMATERIALIEN,
ENZYME,
KITS
17
3.1.2
OLIGONUKLEOTIDE
FIIR
PCR
UND
SEQUENZIERUNG
18
3.1.3
BAKTERIENSTAEMME
19
3.1.4
VEKTOREN
19
3.1.5
MEDIEN
ZUR
KULTUR
VON
E.
COLI
19
3.1.6
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
UND
STAMMLOESUNGEN
20
3.1.7
VERSUCHSTIERE
20
3.1.8
SOFTWARE
22
3.2
M
OLEKULARBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
23
3.2.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
23
3.2.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
24
3.2.3
ISOLIERUNG
VON
MRNA
AUS
GESAMT-RNA
24
3.2.4
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
24
3.2.5
ERSTSTRANG
CDNA-SYNTHESE
AUS
MRNA
25
3.2.6
HERSTELLUNG
DIGOXIGENIN-MARKIERTER
CDNA-SONDEN
25
3.2.7
DURCHMUSTERUNG
VON
CDNA-BANKEN
26
3.2.8
IN
VIVO
AUSSCHLEUSUNG
VON
CDNA-KLONEN
29
3.2.9
DNA-SEQUENZIERUNG
29
3.2.10
DNA-AMPLIFIKATION
DURCH
DIE
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
32
3.2.11
CHROMOSOMENLOKALISATION
35
3.2.12
HERSTELLUNG
DIGOXIGENIN-MARKIERTER
CRNA
35
3.2.13
NORTHERN
BLOT
ANALYSEN
36
3.2.14
REKOMBINANTE
EXPRESSION
IN
E.
COLI
ML
5[PREP4]
37
3.2.15
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
38
3.2.16
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
39
3.2.17
IMMUNHISTOCHEMISCHE
LOKALISATION
DER
VISUELLEN
G-PROTEIN
UNTEREINHEITEN
39
3.2.18
ULTRASTRUKTURELLE
LOKALISATION
DES
VISUELLEN
G-PROTEIN
SSY-KOMPLEXES
40
33
H
ERSTELLUNG
TRANSGENERZ 050/
'
FF/L4MEZAV0GJ5T'AE
41
3.3.1
HERSTELLUNG
VON
APFELSAFTAGARPLATTEN
41
3.3.2
HERSTELLUNG
DER
INJEKTIONSLOESUNG
42
3.3.3
INJEKTION
VON
DROSOPHILA
EMBRYONEN
42
3.4
P
RAEPARATION
BIOLOGISCHEN
M
ATERIALS
43
3.4.1
YYAUGEN-KAPP
"
-PRAEPARATE
VON
DROSOPHILA
UND
PRAEPARATION
VON
DROSOPHILA
KOEPFEN
44
3.4.2
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
YYAUGEN-KAPP
"
-
ODER
KOPF-PRAEPARATEN
VON
DROSOPHILA
44
3.4.3
PRAEPARATION
VON
CALLIPHORA
RETINAE
45
3.4.4
ISOLIERUNG
VON
CALLIPHORA
PHOTOREZEPTORMEMBRANEN
45
3.4.5
EXTRAKTION
VON
RETINAPROTEINEN
UND
RHABDOMERISCHEN
PROTEINEN
VON
CALLIPHORA
46
3.5
B
IOCHEMISCHE
M
ETHODEN
46
3.5.1
SODIUM-DODECYLSULFAT-GEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
46
3.5.2
DURCHFUEHRUNG
DER
SDS-PAGE
47
3.5.3
COOMASSIE-FAERBUNG
48
3.5.4
SILBERNITRATFAERBUNG
48
3.5.5
WESTERN
BLOT
ANALYSEN
48
3.5.6
IMMUNPRAEZIPITATION
50
3.5.7
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
GAQ-,
GSSE
UND
GYE-PROTEINMENGE
IN
DER
LOESLICHEN
UND
MEMBRANGEBUNDENEN
FRAKTION
51
4
E
RGEBNISSE
52
4.1
I
SOLIERUNG
PHOTOREZEPTORSPEZIFISCH
EXPRIMIERTER
G
ENE
52
4.1.1
BESTIMMUNG
DER
CDNA-SEQUENZ
DER
MITTELS
DIFFERENTIELLER
HYBRIDISIERUNG
ISOLIERTEN
CDNA-KLONE
55
4.2
G
EWEBESPEZIFISCHE
T
RANSKRIPTION
DER
ISOLIERTEN
G
ENE
57
43
F
UNKTIONELLE
C
HARAKTERISIERUNG
DES
ISOLIERTEN
G^-G
ENS
(K
LON
SIM
123)
ALS
GY-UNTEREINHEIT
DES
VISUELLEN
G-PROTEINS
DES
FLIEGENAUGES
60
4.3.1
SEQUENZIERUNG
DES
KODIERENDEN
BEREICHS
DER
G^-CDNA
VON
CALLIPHORA
UND
DROSOPHILA
61
4.3.2
PRIMAERSTRUKTUR
DER
GYE-UNTEREINHEITEN
VON
DROSOPHILA
UND
CALLIPHORA
65
4.3.3
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINES
VOLLSTAENDIGEN
CALLIPHORA
GSSE-CDUK
KLONS
67
4.3.4
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
DER
GSSE
UND
GJE-MRNAS
70
4.3.5
CHROMOSOMALE
LOKALISATION
UND
GENSTRUKTUR
DES
DROSOPHILA
GJE-GENS
72
4.3.6
ERZEUGUNG
VON
ANTISEREN
GEGEN
GYE
UND
GSSE
75
4.3.7
SPEZIFITAET
DER
ANTISEREN
GERICHTET
GEGEN
GSSE
UND
GYE
76
4.3.8
IMMUNHISTOCHEMISCHE
LOKALISATION
DER
VISUELLEN
G-PROTEIN
UNTEREINHEITEN
VON
DROSOPHILA
78
4.3.9
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
DES
GSSY-KOMPLEXES
VON
DROSOPHILA
79
4.3.10
GYE
FORMT
MIT
GSSE
DEN
VISUELLEN
GSSY-KOMPLEX
80
4.4
F
UNKTIONELLE
A
NALYSE
DER
G
YC
-U
NTEREINHEIT
MITTELS
TRANSGENER
D
ROSOPHILA
82
4.4.1
HERSTELLUNG
DER
G^E-KONSTRUKTE
FUER
DIE
EXPRESSION
IN
DROSOPHILA
83
4.4.2
ERZEUGUNG
TRANSGENER
DROSOPHILA
LINIEN
ZUR
UEBEREXPRESSION
VON
GYE-MUTIERT
UND
GYE-NATIV
84
4.4.3
WESTERN
BLOT ANALYSE
DER
TRANSGENEN
LINIEN
85
4.4.4
UNTERSUCHUNG
DER
MEMBRANSTAENDIGKEIT
DES
NICHT-FAMESYLIERBAREN
GYE
88
4.4.5
KO-IMMUNPRAEZIPITATION
VON
GSSE
MIT
NICHT-FAMESYLIERBAREM
GYE
91
5
D
ISKUSSION
95
5.1
I
DENTIFIZIERUNG
NEUER
G
ENE
96
5.2
V
ISUELLE
UND
NICHT
-
VISUELLE
G
Y
-U
NTEREINHEITEN
IM
V
ERGLEICH
98
5.3
G
ENSTRUKTUR
DER
G
Y
-U
NTEREINHEITEN
IM
V
ERGLEICH
100
5.4
B
INDUNG
DES
VISUELLEN
G-P
ROTEINS
AN
R
HODOPSIN
UND
FUNKTIONELLE
B
EDEUTUNG
DES
VISUELLEN
SSY-DLMERS
BEI
DER
SIGNALVERMITTLUNG
VOM
RHODOPSIN
ZUM
G
PROTEIN
102
5.5
R
EGULATION
VON
E
FFEKTOREN
DURCH
P
Y
-D
IMERE
105
5.5.1
AKTIVIERUNG
VON
REZEPTORKINASEN
DURCH
SSY-KOMPLEXE
105
5.5.2
INTERAKTION
VON
G-PROTEINEN
MIT
K
+
-UND
CA
2+
-KANAELEN
107
5.5.3
REGULATION
VON
PHOSPHOLIPASEN
109
5.6
F
UNKTION
DES
VISUELLEN
GP
Y
-K
OMPLEXES
IM
P
HOTOREZEPTOR
VON
D
KOSOPHILA
111
5.7
F
UNKTIONELLE
B
EDEUTUNG
DER
F
ARNESVLMODIFIKATION
DER
GYE-UNTEREINHERR
IN
DER
VISUELLEN
S
IGNALTRANSDUKTION
114
6
L
ITERATURVERZEICHNIS
119
7
A
BKUERZUNGSVERZEICHNIS
146
8
ANHANG
149 |
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