Untersuchungen zur Regulation des sol-Operons von Clostridium acetobutylicum:
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|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Göttingen
Cuvillier
2001
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | IX, 147 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3898731308 |
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I
NHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
VI
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
5
2.1
BAKTERIENSTAEMME
5
2.2
PLASMIDE
6
2.3
ZELLANZUCHT
8
2.3.1
NAEHRMEDIEN
8
2.3.1.1
2XYT
MEDIUM
9
2.3.1.2
CB-MEDIUM
9
2.3.1.3
LB-MEDIUM
9
2.3.1.4
PHOSPHATLIMITIERTES
MINIMALMEDIUM,
MES-GEPUFFERT
10
2.3.1.5
PHOSPHATLIMITIERTES
MINIMALMEDIUM
FLIR
KONTINUIERLICHE
KULTUREN
10
2.3.1.6
RCM
(REINFORCED
CLOSTRIDIAL
MEDIUM)
11
2.3.1.7
SOB-MEDIUM
11
2.3.2
SULFATFREIE
MEDIEN
11
2.3.2.1
SULFATFREIES
MINIMALMEDIUM
12
2.3.2.2
SULFATFIEIES
MINIMALMEDIUM
FLLR
C.
ACETOBUTYLICUM
13
2.3.2.3
SULFATFREIES
MINIMALMEDIUM
FUR
E.
COLI
14
2.3.3
MEDIENZUSAETZE
14
2.3.4
HERSTELLUNG
VON
TITAN-(III)-NTA-LOESUNG
ZUR
REDUKTION
VON
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
15
2.3.5
STAMMHALTUNG
15
2.3.6
ANZUCHTBEDINGUNGEN
15
2.3.6.1
STATISCHE
KULTUR
15
2.3.6.2
KONTINUIERLICHE
KULTUR
16
2.3.7
BESTIMMUNG
VON
WACHSTUMSPARAMETEM
16
2.3.7.1
MESSUNG
DER
OPTISCHEN
DICHTE
16
2.3.7.2
MESSUNG
DES
EXTERNEN
PH-WERTS
17
2.3.7.3
GASCHROMATISCHE
ANALYSE
DES
PRODUKTSPEKTRUMS
17
2.4
ARBEITEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
17
2.4.1
BEHANDLUNG
VON
GERAETEN
UND
LOESUNGEN
17
2.4.2
LOESUNGEN,
PUFFER,
WASSER
18
2.4.3
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
19
II
I
NHALTSVERZEICHNIS
2.4.3.1
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
19
2.4.3.2
ETHANOLFAELLUNG
19
2.4.3.3
ISOPROPANOLFAELLUNG
19
2.4.3.4
MIKRODIALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
20
2.4.3.5
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
MITTELS
MIKROKONZENTRATOREN
20
2.4.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEURELOESUNGEN
20
2.4.5
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
21
2.4.6
GROESSENBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREFRAGMENTEN
21
2.4.7
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
21
2.4.7.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-DNA
AUS
CLOSTRIDIEN
21
2.4.7.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-DNA
MITTELS
INSTA-GENEYYMATRIX
22
2.4.7.3
MINI-PRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
AUS
E.
COLI
22
2.4.7.4
MIDI-PRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
AUS
.
COLI
MITTELS
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
23
2.4.7.5
SCHNELLNACHWEIS
VON
PLASMIDEN
IN
E.
COLI
MITTELS
'CRACKING'
23
2.4.7.6
ISOLIERUNG
VON
GESAMT
RNA
23
2.4.8
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
24
2.4.9.
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
DNA
24
2.4.9.1
RESTRIKTIONSSPALTUNG
VON
DNA
24
2.4.9.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
24
2.4.9.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
25
2.4.10
PCR-TECHNIKEN
25
2.4.10.1
STANDARD-PCR
25
2.4.10.2
PCR-VERMITTELTE
EINFUEGUNG
VON
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
26
2.4.10.3
SOE-PCR
26
2.4.11
DNA-TRANSFER
IN
ZELLEN
27
2.4.11.1
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
27
2.4.11.2
ELEKTROPORATION
VON
E.
COLI
27
2.4.11.3
DER
X-GAL
PLATTENTEST
ZUR
SELEKTIONEN
REKOMBINANTER
E.
CO/I-KLONE
2
8
2.4.11.4
ELEKTROPORATION
VON
C.
ACETOBUTYLICUM
28
2.4.11.5
UEBERTRAGUNG
GENETISCHER
ELEMENTE
MITTELS
KONJUGATION
29
2.4.12
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
30
2.4.13
ANALYSE
VON
SEQUENZDATEN
30
2.4.14
'PRIMER
EXTENSION'-ANALYSE
31
2.5
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
32
2.5.1
HETEROLOGE
UEBEREXPRESSION
PLASMIDKODIERTER
PROTEINE
IN
E.
COLI
32
2.5.2
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
32
2.5.3
PRAEPARATION
VON
GEWASCHENEN
MEMBRANEN
AUS
E.
COLI
UND
C.
ACETOBUTYLICUM
3
3
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
2.5.4
ISOLIERUNG
VON
PERIPLASMATISCHEN
PROTEINEN
AUS
.
COLI
33
2.5.5
TCA-FAELLUNG
VON
PROTEINEN
33
2.5.6
BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
34
2.5.7
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
34
2.5.7.1
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
ALDEHYD/ALKOHOL-DEHYDROGENASE
E
35
2.5.7.1.1
BUTYRALDEHYD-DEHDROGENASE-AKTIVITAET
35
2.5.7.1.2
BUTANOL-DEHYDROGENASE-AKTIVITAET
35
2.5.7.2
SS-GALACTOSIDASE-AKTIVITAET
36
2.5.8
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIEN
VON
PROTEINEN
36
2.5.8.1
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
NICKEL-NTA
36
2.5.8.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
AMYLOSE
37
2.5.8.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
TRIAZINYLFARBSTOFFEN
37
2.5.8.4
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
HEPARIN
38
2.5.9
ENTSALZEN
UND
PUFFERWECHSEL
38
2.5.9.1
DIALYSE
38
2.5.9.2
GEIFILTRATION
39
2.5.10
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
39
2.5.11
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
39
2.5.12
ZWEIDIMENSIONALE
ELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
40
2.5.13
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINBANDEN
AUS
2D-GELEN
42
2.5.14
MOLEKULARMASSENBESTIMMUNG
DURCH
SDS-PAGE
4
2
2.5.15
PROTEINFAERBUNGEN
43
2.5.15.1
COOMASSIE-FAERBUNG
43
2.5.15.2
SILBER-FAERBUNG
43
2.5.16
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
44
2.5.16.1
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
MEMBRANEN
44
2.5.16.1.1
TRANSFER
AUF
NITROCELLULOSE
44
2.5.16.1.2
TRANSFER
AUF
PVDF
44
2.5.16.2
DETEKTION
HISTIDIN
ENTHALTENDER
PROTEINE
MIT
NI-NTA-KONJUGAT
45
2.5.16.3
DETEKTION
GLYCOSYLIERTER
PROTEINE
45
2.6
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
45
2.7
BESTIMMUNG
N-TERMINALER
AMINOSAEURESEQUENZEN
46
2.8
CHEMIKALIEN,
GASE,
GERAETE
UND
ENZYME
47
IV
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
49
3.1
REGULATION
DES
SOZ-OPERONS
49
3.1.1
UNTERSUCHUNGEN
DES
EINFLUSSES
VON
STRUKTUREN
IM
BEREICH
STROMAUFWAERTS
DES
ADHE-GENS
49
3.1.1.1
GEZIELTE
MUTAGENESE
VON
POTENTIELL
REGULATORISCHEN
ELEMENTEN
AM
PROXIMALEN
PROMOTER
DES
SOZ-OPERONS
52
3.1.1.2
ANALYSE
DES
EINFLUSSES
DER
EINGEFLLHRTEN
MUTATIONEN
IM
WACHSTUMSVERSUCH
54
3.1.1.3
FALTUNGSSTUDIEN
DER
MRNA
DER
PROMOTERREGION
DES
JOZ-OPERONS
57
3.1.1.4
UEBERPRUEFUNG
DES
PROXIMALEN
PROMOTERS
DES
SOZ-OPERONS
MITTELS
'PRIMER
EXTENSION'-ANALYSE
59
3.1.1.5
UEBERPRUEFUNG
DER
EXPRESSION
VON
ORFL
62
3.1.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
HYPOTHETISCHEN
REPRESSOR
ORF5
64
3.1.2.1
KLONIERUNG
VON
ORF5
ZUR
UEBEREXPRESSION
65
3.1.2.2
HETEROLOGE
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
ORF5
66
3.1.2.3
VERSUCHE
ZU
ORF5-DNA-INTERAKTIONEN
69
3.1.2.4
VERSUCHE
ZUR
HOMOLOGEN
UEBEREXPRESSION
VON
ORF5
IN
C.
ACETOBUTYLKUM
71
3.1.2.5
LOKALISATION
VON
ORF5
72
3.1.2.6
EINFLUSS
DER
UEBEREXPRESSION
VON
ORF5
AUF
DIE
LOESUNGSMITTELBILDUNG
IN
C.
ACETOBUTYLKUM
75
3.1.2.7
EINFLUSS
DER
UEBEREXPRESSION
VON
ORF5
AUF
DIE
PROTEINGLYCOSYLIERUNG
IN
C.
ACETOBUTYLKUM
76
3.1.3
VERSUCHE
ZUR
IDENTIFIKATION
EINES
TRANSKRIPTIONSAKTIVATORS
DES
SOZ-OPERONS
77
3.1.3.1
KONSTRUKTION
DES
PROMOTERTESTVEKTORS
PLACZF
79
3.1.3.2
AUSWIRKUNG
VON
IN
DIE
POSTULIERTE
AKTIVATORSEQUENZ
DES
SOZ-OPERONS
EINGEFUEHRTE
MUTATIONEN
AUF
DIE
EXPRESSION
81
3.1.4
REINIGUNG
UND
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
ALDEHYD-/ALKOHOL
DEHYDROGENASE
E
(ADHE)
AUS
C.
ACETOBUTYLKUM
84
3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZU
SULFONATINDUZIERTEN
SCHWEFELMANGELBEDINGUNGEN
86
3.2.1
UEBERPRUEFUNG
DES
WACHSTUMS
VON
C.
ACETOBUTYLKUM
MIT
SULFONAT-SCHWEFELQUELLEN
87
I
NHALTSVERZEICHNIS
V
3.2.2
VERGLEICH
DES
PROTEINMUSTERS
AUF
SULFAT
BZW.
SULFONAT
WACHSENDER
KULTUREN
VON
C.
ACETOBUTYLICUM,
C.
BEIJERINCKII
EV4
UND
STAMM
RZLAS
88
3.2.3
VERSUCHE
ZUR
KLONIERUNG
DER
GENE
DER
IM
SULFONATMETABOLISMUS
INVOLVIERTEN
PROTEINE
94
3.2.3.1
VERSUCHE
ZUR
KOMPLEMENTATION
VON
E.
COLI
MIT
GENEN
ZUM
ANAEROBEN
SULFONATABBAU
94
3.2.3.2
TRANSPOSONMUTAGENESE
MIT
C.
BEIJERINCKII
EV4
UND
C.
SP.
KNNDS
95
4.
DISKUSSION
97
4.1
DER
PROMOTERBEREICH
DES
SO/-OPERONS
97
4.1.1
DER
PROXIMALE
TRANSKRIPTIONSSTART:
PROMOTER
ODER
PROZESSIERUNG?
97
4.1.2
ANALYSE
DER
POTENTIELL
REGULATORISCHEN
ELEMENTE
DES
HEPTAMERMOTIVS
UND
DES
ORFL
100
4.2
DER
HYPOTHETISCHE
REPRESSOR
ORF5
103
4.2.1
ORF5
IST
KEIN'KLASSISCHER'REPRESSOR
103
4.2.2
EINE
MOEGLICHE
ROLLE
VON
ORF5
IN
DER
GLYKOSYLIERUNG
105
4.3
ASPEKTE
ZUR
REGULATION
DES
SOZ-OPERONS
AUF
EBENE
DER
TRANSKRIPTION
107
4.4
DIE
ALDEHYD-ZALKOHOLDEHYDROGENASE
E
VON
C.
ACETOBUTYLICUM
112
4.5
DER
ANAEROBE
ASSIMILATORISCHE
SULFONATABBAU
117
4.5.1
DIE
AENDERUNG
DES
PROTEINMUSTERS
BEIM
WACHSTUM
AUF
SULFONAT
UND
SULFAT
118
4.5.2
KLONIERUNG
DER
AM
ANAEROBEN
ASSIMILATORISCHEN
SULFONATABBAU
BETEILIGTEN
GENE
121
4.5.3
ASPEKTE
ZUR
TRANSPOSONMUTAGENESE
VON
C.
BEIJERINCKII
EV4
UND
C.SP.
KNNDS
122
5.
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
125
6.
LITERATUR
129 |
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