Biochemische und molekularbiologische Analyse des Polyol-Stoffwechsels in der thermoacidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria:
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| adam_text | INSTITUT FUER PFLANZENPHYSIOLOGIE UND MIKROBIOLOGIE; FREIE UNIVERSITAET
BERLIN BIOCHEMISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE ANALYSE DES
POLYOL-STOFFWECHSELS IN DER THERMOACIDOPHILEN ROTALGE GALDIERIA
SULPHURARIA DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN
DOKTORGRADES AM FACHBEREICH BIOLOGIE-CHEMIE-PHARMAZIE DER FREIEN
UNIVERSITAET BERLIN VORGELEGT VON ROBERT STEIN 2000 GUTACHTER; 1. PROF.
DR. C. SCHNARRENBERGER (FREIE UNIVERSITAET BERLIN) 2. PROF. DR. T. J.
BUCKHOUT (HUMBOLDT UNIVERSITAET ZU BERLIN) INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS V TABELLENVERZEICHNIS VII ABKUERZUNGSVERZEICHNIS X
1 EINLEITUNG 1 1.1 ZUR CHEMIE DER POLYOLE 1 1.2 VORKOMMEN UND FUNKTION
DER ALDITOLE IN PFLANZEN 3 1.3 STOFFWECHSEL DER ALDITOLE 4 1.4 VORKOMMEN
UND FUNKTION DER CYCLITOLE IN PFLANZEN 6 1.5 STOFFWECHSEL VON INOSITOL
IN PFLANZEN 7 1.6 GAIDIERIASULPHURARIA 11 1.7 ZIELE DIESER ARBEIT 14 2
MATERIAL 15 2.1 PFLANZENMATERIAL: GAIDIERIA SULPHURARIA 15 2.1.1 ANZUCHT
15 2.1.2 BESTIMMUNG VON WACHSTUMSRATEN 15 2.1.3 ERNTE DER ALGEN 16 2.2
BAKTERIENSTAEMME UND IHRE ANZUCHT 16 2.3 PHAGEN UND VEKTOREN 17 2.4
GERAETE 17 2.5 CHEMIKALIEN 18 2.6 DATENVERARBEITUNG 18 3
PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN .20 3.1 HERSTELLUNG VON ROHEXTRAKTEN AUS G.
SULPHURARIA 20 3.1.1 AUFSCHLUSS IM BEAD-BEATER 20 3.1.2 SCHNELLER
AUFSCHLUSS IM GYRATOR 20 3.1.3 MODIFIZIERTER AUFSCHLUSS FUER
DIENRYO-LNOSITOL-1-P-SYNTHASE 21 3.2 ENZYMTESTS 21 3.3 PROTEINBESTIMMUNG
23 3.4 REINIGUNG DER CYTOSOLISCHEN »RYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE 23 3.5
REINIGUNG DER PLASTIDAEREN MJO-INOSITOL-DEHYDROGENASE 24 3.6 TRENNUNG DER
MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE ISOENZYME 24 3.6.1 ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG 24 3.6.2 SAEULENCHROMATOGRAPHIE AN FRACTOGEL DEAE TSK-650 24
3.7 GROESSENBESTIMMUNG VON PROTEINEN 25 3.7.1
SACCHAROSEDICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 25 3.7.2
AUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE AN FRACTOGEL TSK HW 55 (S) 26 3.8 SDS- UND
NATIVE-PAGE 26 3.9 NACHWEIS VON PROTEINEN IN GELEN 27 3.9.1
SILBERFAERBUNG 27 3.9.2 COOMASSIEFAERBUNG 27 3.9.3 AKTIVITAETSFAERBUNG VON
ENZYMEN IN NATIVEN POLYACRYLAMID-GELEN 27 3.10 WESTERN BLOT 28 3.10.1
DISKONTINUIERLICHER SEMI-DRY BLOT 28 3.10.2 IMMUNOCHEMISCHER NACHWEIS
VON PROTEINEN AUF MEMBRANEN 28 3.11 IDENTIFIZIERUNG DER
REAKTIONSPRODUKTE DER POLYOL-DEHYDROGENASEN MITTELS HPLC 29 3.12
HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN 29 3.13 IMMUNOGOLD-MARKIERUNG VON
ULTRADUENNSCHNITTEN 30 3.14 SEQUENZIERUNG VON PROTEINEN 30 4
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 31 4.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS G.
SULPHURARIA 31 4.2 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS G. SULPHURARIA 31 4.3
ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN 32 4.3.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON RNA 32 4.3.2 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON
DNA 32 4.3.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON DNA MIT DER
GLASSCHEIBEN-TECHNIK 33 4.4 KAPILLARTRANSFER VON RNA AUF NYLON-MEMBRANEN
UND HYBRIDISIERUNG (NORTHERN BLOT) 33 4.5 ELUTION VON DNA AUS
AGAROSE-GELEN MIT QIAQUICK-SAEULEN 34 4.6 QUANTIFIZIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN 34 4.7 ERSTELLEN EINER T-ZAP-CDNA-BANK AUS AUTOTROPHEN
ZELLEN VON G. SULPHURARIA 35 4.7.1 ISOLATION VON GESAMT-RNA 35 4.7.2
ISOLIERUNG VON POLY (A) + -RNA AUS GESAMT-RNA 35 4.7.3
ERST-STRANG-SYNTHESE 36 4.7.4 ZWEIT-STRANG-SYNTHESE 36 4.7.5 BLUNTING
DER CDNA-TERMINI 37 4.7.6 LIGATION DER CORI-ADAPTOREN 37 II 4.7.7
PHOSPHORYLIERUNG DER FICORI-ENDEN 37 4.7.8 RESTRIKTION MIT XHOL 38 4.9.9
GROESSENFRAKTIONICRUNG 38 4.7.10 LIGATION IN UNI-ZAP-XR-VEKTORARME 38
4.7.11 BESTIMMUNG DES TITERS DER CDNA-BANK MIT DEM
SS-GALACTOSIDASE-NACHWEIS 39 4.7.12 AMPLIFIKATION 39 4.8
ZYMOGRAMM-SCREENING EINER X-ZAP-CDNA-BANK 39 4.9 IN V/VO-EXCISION DES
PBLUESCRIPT PHAGEMIDS AUS DEM PHAGEN X-ZAP 41 4.10 SCHNELLPRAEPARATION
VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN IM KLEINMASSSTAB 42 4.11 ULTRAREINE
PLASMIDPRAEPARATION AUS BAKTERIEN 42 4.12 IN VI VO-EXPRESSION VON GENEN
IN E. COLI MIT PBLUESCRIPT 43 4.13 IN VIVO-EXPRESSION PUTATIV POSITIVER
MIT DEM TNT COUPLED WHEAT GERM EXTRACT SYSTEM 43 4.14 EXPRESSION VON
GENEN IN E. COLI DURCH PHAGENINFEKTION 44 4.15 PCR-AMPLIFIZIERUNG VON
PBLUESCRIPT SK(+/-)-CDNA-INSERTS AUS PHAGENLYSATEN 44 4.16
PCR-AMPLIFIZIERUNG VON FRAGMENTEN DER 18SRRNA AUS GENOMISCHER DNA VON G.
SULPHURARIA 44 4.17 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 45 4.18
SEQUENZIERUNG VON DNA 46 5 ERGEBNISSE .47 5.1 NACHWEIS ZWEIER
MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-ISOENZYME IN G. SULPHURARIA 47 5.1.1
REINIGUNG DER CYTOSOLISCHEN NTYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE 49 5.1.2
REINIGUNG DER PLASTIDAEREN NYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE 50 5.1.3
CHARAKTERISIERUNG DERNRYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-ISOENZYME 51 5.1.4
KLAERUNG DER INTRAZELLULAEREN LOKALISATION 55 5.1.5 INDUKTION DER
MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-ISOENZYME 58 5.2 NACHWEIS EINER
MYO-INOSITOL-L-P-SYNTHASE IN G. SULPHURARIA 60 5.3 WERDEN ALLE
OFFENKETTIGEN ZUCKERALKOHOLE UEBER XYLITOL- UND D-ARABITOL- DEHYDROGENASE
IN DEN STOFFWECHSEL VON G. SULPHURARIA EINGESCHLEUST? 60 5.4
SUBSTRATAFFINITAET DER XYLITOL- UND DER D-ARABITOL-DEHYDROGENASE 62 5.5
INDUKTION DER XYLITOL- UND D-ARABITOL-DEHYDROGENASE BEI HETEROTROPHEM
WACHSTUM 65 5.6 KLONIERUNG DER GENE DER
MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-ISOENZYME, DER D-ARABITOL- UND DER
XYLITOL-DEHYDROGENASE 66 5.6.1 ISOLIERUNG VON SPEZIFISCHEN CDNA-KLONEN
66 5.6.2 VERIFIZIERUNG DER CDNA-KLONE 74 III 5.7 CHARAKTERISIERUNG DER
POLYOL-DEHYDROGENASE-KLONE IDH67, IDH30, XYLDH13 UND ARADH26 75 5.7.1
CHARAKTERISIERUNG DES FUER DIE PLASTIDAERE MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE
CODIERENDEN CDNA-KLONES IDH67 76 5.7.2 CHARAKTERISIERUNG DES FUER DIE
CYTOSOLISCHE NRYO-INOSITOL- DEHYDROGENASE CODIERENDEN CDNA-KLONES
IDH30 79 5.7.3 CHARAKTERISIERUNG DES FUER DIE XYLITOL-DEHYDROGENASE
CODIERENDEN CDNA-KLONES XYLDH13 80 5.7.4 CHARAKTERISIERUNG DES FUER DIE
D-ARABITOL-DEHYDROGENASE CODIERENDEN CDNA-KLONES ARADH26 52 5.8
VERGLEICH DER AMINOSAEURE-SEQUENZEN DER MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-
ISOENZYME MIT SEQUENZEN ANDERER ORGANISMEN 85 5.9 VERGLEICH DER XYLITOL-
UND D-ARABITOL-DEHYDROGENASE AMINOSAEURE- SEQUENZEN MIT SEQUENZEN ANDERER
ORGANISMEN 88 5.10 EXPRESSION DER XYLITOL-, D-ARABITOL- UND DER
MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE- ISOENZYME IN G. SULPHURARIA 92 6 DISKUSSION
95 6.1 STOFFWECHSEL VON RYO-INOSITOL 95 6.1.1 DIE
MYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-ISOENZYME 95 6.1.2 WELCHE ROLLE SPIELEN DIE
NRYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-ISOENZYME IN G. SULPHURARIA } 9 7 6.1.3
INDUKTION DERMYO-INOSITOL-DEHYDROGENASE-ISOENZYME 99 6.2 MOLEKULARE UND
BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN DER D-ARABITOL- UND XYLITOL- DEHYDROGENASE
100 6.3 PHYLOGENETISCHE ANALYSE DER D-ARABITOL- UND
XYLITOL-DEHYDROGENASE 102 6.4 STOFFWECHSEL VON ALDITOLEN 104 7
ZUSAMMENFASSUNG 107 8 LITERATUR 108 9 ANHANG 119 IV
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