Gentechnische Herstellung von mutiertem murinem Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1) als Rezeptorantagonist:
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| adam_text | -5L-(O GENTECHNISCHE HERSTELLUNG VON MUTIERTEM MURINEM MONOCYTE
CHEMOATTRACTANT PROTEIN 1 (MCP-1) ALS REZEPTORANTAGONIST VOM FACHBEREICH
BIOLOGIE DER UNIVERSITAET HANNOVER ZUR ERLANGUNG DES GRADES DOKTOR DER
NATURWISSENSCHAFTEN -DR.RER.NAT.- GENEHMIGTE DISSERTATION VON
DIPL.-BIOL. MICHAEL WAHL GEBOREN AM 25.09.1967 IN EHRINGSHAUSEN 1998
INHALTSVERZEICHNIS ZUSAMMENFASSUNG IV ABSTRACT V INHALTSVERZEICHNIS VI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IX 1. EINLEITUNG 1 1.1 ENTZUENDUNG 1 1.2 CHEMOKINE
UND IHRE REZEPTOREN 2 1.3 MONOCYTE CHEMOATTRACTANT PROTEIN-1 5 1.4 MCP-1
IN DER GLOMERULONEPHRITIS 7 1.5 REZEPTORANTAGONISTEN VON CHEMOKINEN 8
1.6 DAS HEFEEXPRESSIONSSYSTEM PICHIA PASTORIS 9 1.7 ZIELE DER ARBEIT 12
2. MATERIAL UND METHODEN 14 2.1 MATERIAL 14 VERBRAUCHSMATERIAL 14 GERAETE
14 CHEMIKALIEN, ENZYME UND MIKROORGANISMEN 15 ANTIKOERPER, CDNAS,
OLIGONUKLEOTID-PRIMER UND PLASMIDE 18 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5
2.1.6 2.2 ANTIKOERPER: OLIGONUKLEOTIDPRIMER VERWENDETE PLASMIDE:
VERWENDETE ZELLEN PROTOKOLLE ZUR HERSTELLUNG DER STAMMLOESUNGEN UND
MEDIEN ZUR KULTIVIERUNG VON P.PASTORIS ZELLKULTUR 18 18 20 21 22 22
2.2.1 IF-12-ZELLEN 23 2.2.2 MILZZELLPRAEPARATION 23 2.2.3 RAW264.7-ZELLEN
24 2.2.4 EL-4C-ZELLEN 24 2.2.5 MAUS-MESANGIUMZELLEN 24 2.2.6
ZELLZAHLBESTIMMUNG 25 23 RNA-TECHNIKEN 25 2.3.1 ISOLIERUNG ZELLULAERER
GESAMT-RNA 25 2.3.2 AGAROSEGELELEKTROPHORESE UND NORTHERN BLOTTING VON
RNA 26 2.3.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON CDNA-FRAGMENTEN 27 2.3.4
HYBRIDISIERUNG 28 2.4 DNA-TECHNIKEN 29 2.4.1 PCR 29 2.4.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE 33 VI 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7 2.4.8 2.4.9
2.4.10 2.4.11 15 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2.5.5 2.5.6 25.7 2.5.8 2.5.9
2.5.10 2.5.11 2.5.12 2.5.13 2.5.14 2.5.15 Z6 GELEXTRAKTION DER DNA 34
PHENOL-CHLOROFORM-AUFREINIGUNG VON DNA 35 LIGATION 35 TRANSFORMATION VON
. CO//-BAKTERIEN 37 ANLEGEN EINER BAKTERIEN-DAUERKULTUR 38
PLASMID-PRAEPARATIONEN 39 DURCHFUEHRUNG DER SITE-DIRECTED MUTAGENESIS 40
ANALYSE DER POSITIVEN KLONE 43 TRANSFORMATION VON PICHIA PASTORIS 44
PROTEINTECHNIKEN 45 PROTEINEXPRESSION DURCH ESCHERICHIA COLI JM109 45
AUFREINIGUNG DES GST-MCP-1-FUSIONSPROTEINS 45 PROTEINEXPRESSION DURCH
PICHIA PASTORIS 46 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 46 GEFRIERTROCKNUNG
VON PROTEINEN 47 AUFKONZENTRATION VON PROTEINEN 47 ENTSALZUNG DES
PROTEINS 47 FPLC 48 BIOTINYLIERUNG DES ANTI-MCP-1 -ANTIKOERPERS 49
ANTI-MMCP-1-ELISA 50 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 51
SILBERFAERBUNG 52 WESTERN-BLOT 53 GLYKOSIDASE-VERDAU 55
JODACETAMID-BEHANDLUNG 55 MESSUNOEN ZUR BIOAKTIVITAET 55 2.6.1
INTRAZELLULAERE KALZIUMMESSUNG 55 2.6.2 MIGRATIONSTESTS 58 3. ERGEBNISSE
61 3.1 EXPRESSION VON MCP-1MRNA DURCH VERSCHIEDENE MURINE ZELLEN 61 3.2
GENERIERUNO DER MCP-1-EXPRESSIONSVEKTOREN 64 3.2.1 HERSTELLUNGEINES
WILDTYP-MCP-1-KONSTRUKTESFUER E. COLI 64 3.2.2 HERSTELLUNG EINES
WILDTYP-MCP-1-KONSTRUKTES FUER P.PASTORIS 64 3.2.3 HERSTELLUNG DES MCP-1
(1-8DEL)-KONSTRUKTES 78 3.3 EXPRESSION DER MCP-1-PROTEINE 84 3.3.1
EXPRESSION VON WILDTYP-MCP-1 DURCH ESCHERICHIA COLI. 84 3.3.2 EXPRESSION
VON WILDTYP-MCP-1 DURCH PICHIA PASTORIS. 88 3.3.3 EXPRESSION VON
MCP-1(1-8DEL) DURCH PICHIA PASTORIS 95 3.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR
BIOAKTIVITAET 97 3.4.1 ETABLIERUNG UND OPTIMIERUNG DES SYSTEMS 97 3.4.2
ANALYSE DER EXPRIMIERTEN WILDTYP-MCP-1 -PROTEINE IM VERGLEICH ZUR
N-TERMINAL VERKUERZTEN MUTANTE MCP-1 (1-8 DEL) 107 A) MCCR2-PCR 98 VII A)
MCCR2-PCR 98 B) KALZIUMMESSUNGEN 99 C) MIGRATIONSEXPERIMENTE 103 4.
DISKUSSION 112 5. LITERATURVERZEICHNIS 121 VIII
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