Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) als wertvolles Instrument zur Strukturaufklärung von Protein-DNA-Komplexen:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
_1
2 THEORIE
_5
\
2.1 ABSORPTION UND FLUORESZENZ 5
2.2 FLUORESZENZ RESONANZ ENERGIE TRANSFER (FRET) 8
2.3 EXPERIMENTELLE BESTIMMUNG DER FRET-EFFIZIENZ 11
2.4 FLUORESZENZPOLARISATION UND ANISOTROPIE 14
2.5 FLUORESZENZLEBENSDAUER 16
2.5.1 PULS-METHODE ~~ 16
2.5.2 PHASEN-MODULATIONS-METHODE 16
3 UV-VIS UND FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE EIGENSCHAFTEN
DER FARBSTOFFE 6-FAM UND 5-TMRH
_19
3.1 UV-VIS 19
3.2 FLUORESZENZ 19
4 PROTEIN-DNA-KOMPLEXE
_21
4.1 INTEGRATION HOST FACTOR (IHF*) 23
4.1.1 GELEXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN DER IHF-DNA-KOMPLEXE 25
4.1.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG DER IHF-DNA-KOMPLEXE 27
4.1.2.1 MESSUNGEN DER ANISOTROPIE UND DER FLUORESZENZINTENSITAET
27
4.1.2.2 BESTIMMUNG DER ENERGIETRANSFER-EFFIZIENZ
30
4.1.3 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN DER IHF-DNA-KOMPLEXE 34
4.1.4 DISKUSSION 36
4.2 HIGH MOBILITY GROUP (HMG)-PROTEINE 39
4.2.1 BESTIMMUNG DER ANZAHL DER PROTEIN-BINDUNGSSTELLEN 41
4.2.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN DER HMG-DNA-KOMPLEXE 43
4.2.3 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN 46
4.2.4 DISKUSSION 48
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
4.3 FACTOR FOR INVERSION STIMULATION (FIS)
4.3.1 GELEXPERIMENTELLE MESSUNG AM FIS-DNA-KOMPLEX
4.3.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE MESSUNGEN AM FIS-DNA-KOMPLEX
4.3.2.1 STATIONAERE FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
4.3.2.2 ZEITAUFGELOESTE FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
4.3.3 DISKUSSION
4.4 DISKUSSION
51
53
54
54
56
59
60
* VERGLEICH ZWISCHEN DA UND DA
,TA,-BULGE
5.1 MOBILITAET IM POLYACRYLAMIDGEL
5.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE MESSUNGEN
5.3 DISKUSSION
6 FRFT IM GEL
--
6.1 QUOTIENTEN-VERFAHREN
6.2 YYFRET IN PAGE" - QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER FRET-EFFIZIENZ
6.2.1 THEORIE
6.2.2 BESTIMMUNG DER FRET-EFFIZIENZ
6.2.3 EINFLUSS DER GELMATRIX AUF DIE DONORFLUORESZENZ
6.3 DISKUSSION
68
70
75
75
76
80
82
7 ZUSAMMENFASSUNG
8 MATERIAL UND METHODEN
_
8.1 GERAETE
8.2 CHEMIKALIEN
8.3 PUFFER UND LOESUNGEN
8.4 SEQUENZEN DER OLIGONUKLEOTIDE
8.5 OLIGONUKLEOTID-SYNTHESE
8.6 AUFREINIGUNG DER OLIGONUKLEOTIDE
8.7 HYBRIDISIERUNG DER EINZELSTRAENGIGEN OLIGONUKLEOTIDE
8.8 ZENTRIFUGATIONSCHROMATOGRAPHIE
89
89
89
90
91
92
92
94
94
INHALTSVERZEICHNIS
8.9 CHARAKTERISIERUNG DER UNTERSUCHTEN PROTEINE 95
8.10 BAND-SHIFT-EXPERIMENTE 95
8.11 SPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 96
8.11.1 ABSORPTIONSSPEKTROSKOPISCHE MESSUNGEN 96
8.11.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE MESSUNGEN 97
8.11.2.1 STATIONAERE FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
97
8.11.2.2 ANISOTROPIEMESSUNG
97
8.11.2.3 MESSUNG DER FLUORESZENZLEBENSDAUER
97
8.12 BESTIMMUNG DER ENERGIETRANSFER-EFFIZIENZ NACH DER (RATIO)A-METHODE
98
8.13 FRET IM GEL 98
8.13.1 EINFLUSS DES POLYACRYLAMIDGELS AUF DIE FLUORESCEINFLUORESZENZ 99
8.13.2 EINFLUSS DER GELKONZENTRATION AUF DIE FLUORESZENZ 99
9 LITERATUR
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