Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG 1
1.1 DIE EPIDERMIS: AUFBAU UND FUNKTION.1
1.2 DIE EPIDERMIS ALS MODELLSYSTEM FUER ZELLDIFFERENZIERUNG.3
1.3 REGULATION VON KERATINOZYTAEREM WACHSTUM UND DIFFERENZIERUNG
IN VITRO
.3
1.4 INTRAZELLULAERE REGULATIONSMECHANISMEN DER
KERATINOZYTENDIFFERENZIERUNG.4
1.5 DIE ROLLE MITOGEN-AKTIVIERTER SIGNALWEGE BEI DER REGULATION VON
ZELLWACHSTUM
UND -DIFFERENZIERUNG.8
1.6 SLOO-PROTEINE UND DEREN ROLLE IN KERATINOZYTENDIFFERENZIERUNG.10
1.7MRP8 UND MRP14, DIFFERENZIERUNGSSPEZIFISCH EXPRIMIERTE SLOO-PROTEINE
IN
KERATINOZYTEN?.11
1.8 FRAGESTELLUNGEN. 13
2
MATERIAL 14
2.1 CHEMIKALIEN.14
2.2 LOESUNGEN, MEDIEN UND PUFFER.14
2.3 ENZYME.17
2.4 PHARMAKOLOGISCHE INHIBITOREN UND ZYTOKINE.17
2.5 REKOMBINANTE PROTEINE.18
2.6 ANTIKOERPER.18
2.6.1 ANTIKOERPER UND ANTISEREN FUER WESTEMBLOT UND IMMUNPRAEZIPITATION
(IP). 18
2.6.2 ANTIKOERPER FUER IMMUNFLUORESZENZ (IF) UND IMMUNHISTOCHEMIE (IH).19
2.7 REAGENZSAETZE (KITS).19
2.8 SPEZIELLE REAGENZIEN.19
2.9 ZELLKULTURMATERIAL.20
2.9.1 MEDIEN UND MEDIENZUSAETZE.20
2.9.2 SONSTIGER ZELLKULTURBEDARF.20
2.10 PLASMIDE.21
2.10.1 PLASMIDE ZUR GENEXPRESSION IN SAEUGERZELLEN.21
2.10.2 AUSGANGSPLASMIDE FUER DIE HERSTELLUNG VON RNA-PROBEN FUER
IN-SITU
HYBRIDISIERUNG.21
2.11 ZELLEN UND BAKTERIENSTAEMME.22
2.12 HAUTBIOPSIEN FUER
IN
SITW-HYBRIDISIERUNG UND IMMUNHISTOLOGIE.22
2.13 GERAETE.22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3 METHODEN
24
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE STANDARDMETHODEN.24
3.2 ARBEITEN MIT DNA.24
3.2
.1
TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN BAKTERIEN.24
3.2.2 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.24
3.2.3 MIDI- UND MAXIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.25
3.2.4 SEQUENZIERUNG VON DNA.25
3.2.5 DNA-ELUTION AUS AGAROSEGELEN.25
3.
2.6
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA-LOESUNGEN.25
3.3 ZELLKULTUR.26
3.3.1 PASSAGIERUNG VON ZELLEN.26
3.3.2 WEGFRIEREN, LAGERUNG UND REKULTIVIERUNG VON ZELLEN.27
3.3.3 KULTUR DER HACAT-ZELLINIE.27
3.3.4 KULTUR PRIMAERER NHEK-ZELLEN.29
3.3.5 STIMULATION UND INHIBITORINKUBATION.30
3.4 PROTEINANALYSE.
3.4
.1
LYSIS HUMANER KERATINOZYTEN ZUR PROTEINANALYSE.31
3.4.2 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).31
3.4.3 WESTEMBLOT.
32
3.4.4 IMMUNKOMPLEX-KINASEASSAYS.
33
3.4.5 RAS-AKTIVIERUNGSASSAYS.
34
3.4.6 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG.
35
3.4.7 IMMUNHISTOCHEMIE.36
3.5 IN SITU-HYBRIDISIERUNG.
37
3.6 ELEKTRONENMIKROSKOPIE (TRANSMISSIONS-ELEKTRONENMIKROSKOPIE).39
4 ERGEBNISSE
41
4.1 ETABLIERUNG EINES
IN
V/YRO-MODELLSYSTEMS FUER DIFFERENZIERUNGSSTUDIEN.41
4.2 AKTIVIERUNG DES RAFTMEK/ERK-SIGNALWEGES DURCH EXTRAZELLULAERES
CALCIUM.
43
4.3 EXTRAZELLULAERES CALCIUM STIMULIERT ERK IMABHAENGIG VON RAS-AKTIVITAET.
47
4.4 CALCIUMINDUZIERTE ERK-AKTIVIERUNG IST ABHAENGIG VON DER
INTRAZELLULAEREN
CALCIUMKONZENTRATION, ABER UNABHAENGIG VON PKC-AKTIVIERUNG.50
4.5 MEK-INHIBITON VERHINDERT DIE CALCIUMINDUZIERTE EXPRESSION DES
CYCLINABHAENGIGEN
KINASEINHIBITORS P21/CIPL.
53
4.6 CALCIUMINDUZIERTE EXPRESSION DES DIFFERENZIERUNGSMARKERS INVOLUCRIN
KANN DURCH
MEK-INHIBITION BLOCKIERT WERDEN.54
4.7 CALCIUMINDUZIERTE DIFFERENZIERUNG HUMANER KERATINOZYTEN GEHT MIT
ERHOEHTER
EXPRESSION VON MRP
8
UND MRP14 EINHER.56
4.8MRP8 UND MRP14 WERDEN IM HAARFOLLIKEL EXPRIMIERT UND KOENNEN IN
SUPRABASALEN
SCHICHTEN DER EPIDERMIS INDUZIERT WERDEN.60
4.9 IL
-6
INDUZIERT MRP8/MRP14-EXPRESSION IN VITRO.
66
4.10 ARSENITSTIMULATION FUHRT ZUR TRANSLOKATION VON MRP8/MRP14-KOMPLEXEN
AN
ZYTOSKELETTSTRUKTUREN.69
5 DISKUSSION 71
5.1 CALCIUMINDUZIERTE DIFFERENZIERUNG VON KERATINOZYTEN WIRD VON
TRANSIENTER
AKTIVIERUNG DES RAFTMEK/ERK-SIGNALWEGES BEGLEITET.71
5.2 CALCIUMINDUZIERTE AKTIVIERUNG DES RAF/MEK/ERK-SIGNALWEGES ERFOLGT
UNABHAENGIG
VON RAS UND KLASSISCHEN PKCS. 72
5.3 MOEGLICHE MECHANISMEN DER AKTIVIERUNG DES RAF/MEK/ERK-SIGNALWEGES
DURCH
EXTRAZELLULAERES CALCIUM.74
5.4 FUNKTION DER CALCIUMINDUZIERTEN STIMULATION DES
RAF/MEK/ERK-SIGNALWEGES FUER DIE
INITIATION DER KERATINOZYTENDIFFERENZIERUNG.76
5.5 DIFFERENZIERUNGSSPEZIFISCHE EXPRESSION DER BEIDEN SLOO-PROTEINE MRP
8
UND
MRP14 IN KERATINOZYTEN.78
5.6 INDUKTION VON MRP8/MRP14 DURCH IL
-6
.80
5.7 REGULATION DER MRP8/MRP14-FUNKTION.81
5.8 AUSBLICK.84
6 ZUSAMMENFASSUNG 88
6.1 ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG.F.
88
6.2 ZUSAMMENFASSUNG.89
6.3 SUMMARY.90
7 LITERATUR 91
8 ANHANG 105
8
.1 ABKUERZUNGEN.105
DANKSAGUNG
107 |
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