Untersuchungen zur HIV-spezifischen Immunantwort:
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3
ZUSAMMENFASSUNG
.
7
1
EINLEITUNG
.
8
1.1
ENTDECKUNG
UND
KLASSIFIZIERUNG
VON
HIV
.
8
1.2
DAS
HIV
1
GENOM
.
9
1.3
DER
VIRALE
REPLIKATIONSZYKLUS
.
10
1.4
DAS
NEF-PROTEIN
VON
HIV-1
.
11
1.4.1
ERHOEHUNG
DER
VIRALEN
INFEKTIOSITAET
.
12
1.4.2
HERABREGULATION
VON
CD4
UND
MHC
KLASSE
1
.
12
1.4.3
MODULATION
DER
ZELLULAEREN
SIGNALWEGE
.
13
1.5
TROPISMUS
.
14
1.6
DIE
HIV-SPEZIFISCHE
T-ZELLANTWORT
.
15
1.7
ASSOZIATION
ZWISCHEN
INFEKTIONSRISIKO
BZW
KRANKHEITVERLAUF
UND
HLA-GENOTYP
.
16
1.8
ANTIVIRALE
THERAPIE
.
18
1.8.1
INHIBITOREN
DER
REVERSEN
TRANSKRIPTASE
.
1
8
1.8.2
INHIBITOREN
DER
VIRALEN
PROTEASE
.
18
1.8.3
DIE
KOMBINATIONSTHERAPIE
.
19
1.8.4
RESISTENZTESTUNG
IM
RAHMEN
DES
THERAPIEMONITORINGS
BEI
HIV-INFEKTION.
19
1.8.5
METHODEN
ZUR
HIV-RESISTENZTESTUNG
.
20
WISSENSCHAFTLICHE
FRAGESTELLUNG
.
21
2.
MATERIAL
.
23
2.1
GERAETE
.
23
2.2
VERBRAUCHSMATERIAL
.
24
2.3
CHEMIKALIEN
.
24
2.4
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
25
2.5
BIOLOGISCHES
MATERIAL
.
26
2.5.1
EUKARYOTE
ZELL-LINIEN
.
26
2.5.2
BAKTERIENSTAEMME
.
26
2.5.3
VIRUSSTAEMME
.
26
4
2.6
NUKLEINSAEUREN
.
27
2.6.3
DIVERSE
NUKLEINSAEUREN
.
29
2.7.
ENZYME
.
30
2.8.
ANTIKOERPER
.
30
3
METHODE
.
32
3.1
DNA
EXTRAKTION
.
32
3.1.1
GENOMISCHE
DNA.
32
3.1.2
PLASMID
DNA.
.'
.
32
3.1.3
AUFREINIGUNG
NACH
PCR
ODER
RESTRIKTION
.
32
3.2
RNA
.
32
3.2.1
VIRALE
RNA.
32
3.2.2
ZELLULAERE
RNA
.
32
2.3
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
32
3.3
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
.
32
3.4
SPEKTRATYPING
.
33
3.4
NICHTRADIOAKTIVES
SEQUENZIEREN
MIT
DEM
ABI
373
SEQUENCER
.
34
3.5
LIGATION
.
34
3.6
RESTIKTIONSVERDAU
.
34
3.7
AGAROSE
GELELEKROPHORESE
.
34
3.8
TRANSFEKTION
VON
EUKARIONTENZELLEN
.
34
3.8.1
ELEKTROPORATION
.
34
3.8.2
LIPOSOMEN
.
35
3.9
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
DURCH
HITZESCHOCK
.
35
3.10
ZELLZAHL
UND
VITALITAETSBESTIMMUNG
.
35
3.11
ZELLKULTUR
.
35
3.11.1
ADHAERENT
WACHSENDE
ZELLEN
.
35
3.11.2
MAKROPHAGENKULTUR:
.
36
3.11.3
SUSPENSIONSKULTUREN
.
36
3.11.4
PHA-BLASTEN
.
36
3.11.5
EBV-BLASTEN:
.
36
3.11.6
CTL-KULTUR
.
36
3.11.7
ZELLKLONIERUNG
.
36
3.12
VIRUSKULTUR
.
37
5
3.12.1
PHA-BIASTEN
KULTUR
.
37
3.12.2
MAKROPHAGENKULTUR
.
37
3.12.3
VIRUSKULTUR
IN
ZELL-LINIEN
.
37
3.13
KRYOKONSERVIERUNG
VON
ZELLEN:
.
38
3.14
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
(FACS-ANALYSE)
.
38
3.14.1
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
38
3.14.2
DIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
38
3.14.3
INTRAZYTOPLASMATISCHE
IMMUNFLUORESZENZ
.
39
3.15
P24-ELISA
.
39
3.16
WESTEMBLOT
.
39
3.17
CTL-ZYTOTOXIZITAETSTEST
.
40
3.18
HLA-TYPISIERUNG
.
40
3.19
KONSTRUKTION
DER
REKOMBINANTEN
HL-VIREN
.
41
3.19.1
KONSTRUKTION
DER
DELETIONSMUTANTE
NL43D2368
.
41
3.18.2
DIE
HERSTELLUNG
DER
REKOMBINANTEN
VIRUS-DNA.
41
3.18.3
TRANSFEKTION
VON
293T-ZELLEN
ZUR
HERSTELLUNG
REKOMBINANTEN
VIRUSSTOCKS
.
42
3.18.4
MESSUNG
DER
REPLIKATIONSGESCHWINDIGKEIT
.
42
4.ERGEBNISSE
.
43
4.1
FUNKTIONELLE
UND
MOLEKULARE
ANALYSE
VON
VIRALEN
CTL-FLUCHTMUTATIONEN
.
43
4.1.1
ISOLIERUNG
HIV-SPEZIFISCHER
ZYTOTOXISCHER
T-ZELLEN
.
43
4.1.2
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
PR/RT-VARIANTEN
.
48
4.1.2.1
KONSTRUKTION
DER
DELETIONSMUTANTE
NL43D2383
.
48
4.1.2.2
LIGATIONSEFFIZIENZ
.
50
4.1.2.3
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
.
50
4.1.2.4
REPLIKATIONSGESCHWINDIGKEIT
DER
REKOMBINANTEN
HL-VIREN
.
50
4.1.2.5
DAS
SEQUENZALIGNEMENT
DER
REKOMBINANTEN
VIREN
.
51
4.2
SEQUENZANALYSE
DER
HIV-NEF
GENE
.
56
4.3
NEF-VARIABILITAET
UND
HLA-KLASSE-I-MOLEKUELE
.
62
4.4
HLA-TYP
UND
KORRELATION
ZUM
KRANKHEITSVERLAUF
.
63
5
DISKUSSION:
.
67
5.1
FUNKTIONELLE
UND
MOLEKULARE
ANALYSE
VON
VIRALEN
CTL-FLUCHTMUTATIONEN
.
67
5.1.1
ANALYSE
VON
HIV
SPEZIFISCHEN
CTL-LINIEN
.
67
5.1.2
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
HL-VIREN
.
68
6
5.2
ANALYSE
DER
HLA-KLASSE-L-GENE
.
71
5.3
SEQUENZENANALYSE
DER
HIV-NEF
GENE
.
73
6
LITERATUR
.
76
7
ANHANG
.
88
7.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
88
7.1.1
IUPAC
NOMENKLATUR
.
89
7.1.2
EIN
BUCHSTABEN
KODE
DER
AMINOSAEUREN
.
89
7.2
ALIGNEMENT
DER
NEF
GENE
.
91
7.3
DANKSAGUNGEN
.
94
7.4
LEBENSLAUF:
.
95 |
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