Subzelluläre Kompartimentierungen und Trafficking der Glucosetransporter GLUT4 und GLUT1 in isolierten Herzmuskelzellen adulter Ratten:
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Mainz
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Inhaltsverzeichnis
i Einleitung 3
1.1 Der Transport der Glucose 3
1.2 Das Trafficking der Glucosetransporter 5
II Material und Methoden 13
II. 1 Verwendete Materialien 13
11.1.1 Chemikalien 13
11.1.2 Geräte 14
11.2 Isolierung von Herzmuskelzellen 15
11.3 Behandlung der Zellen 16
11.4 Glucosetransport-Messung 17
11.5 Präparation von Zellmembranfraktionen 18
11.6 Nachweis von Glucosetransportern und spezifischen Marker-Proteinen in
isolierten Zellmembranfraktionen 20
11.6.1 Proteinbestimmung 20
11.6.2 Gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen 20
11.6.3 Western Blot 21
11.6.4 Silver Staining 22
11.7 Immunadsorption von LDM-Subpopulationen 23
11.8 Immunzytochemischer Nachweis von GLUT4 und GLUT1 in der
Konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie 25
11.9 Statistische Auswertung 27
in Ergebnisse 28
III. 1 Glucosetransport und Verteilung der Glucosetransporter GLUT4 und GLUT1
in Membranfraktionen von Herzmuskelzellen: Wirkung von Insulin 28
III.1.1 Plasmamembranen und Low Density Microsomes 28
III. 1.2 High Density Microsomes 31
111.2 Die endosomalen Markerproteine SCAMPs und ihre Beziehung zu den GLUTs 33
111.3 Immunchemische Charakterisierung der subzellulären Kompartimentierungen und
des Traffickings von GLUT4 und GLUT1 in isolierten Kardiomyozyten 35
111.3.1 Bestimmung des Kolokalisierungsgrades zwischen GLUT4, GLUT1 und
SCAMPs innerhalb der LDM-Fraktion basaler, nicht-stimulierter
Herzmuskelzellen 35
111.3.2 Einfluß von Insulin auf die Verteilung von GLUT4 und GLUT1 in
LDM-Subpopulationen 40
111.3.3 Dynamik der Insulin-bedingten Rekrutierung von GLUT4 und GLUT1 aus
LDM-Vesikelpopulationen an die Zelloberfläche 42
111.3.4 Umverteilung von GLUT4 und GLUT1 von der Zelloberfläche zurück in
LDM-Vesikelpopulationen während des Abklingens der Insulin-Wirkung 49
111.4 Einfluß weiterer Modulatoren des kardiomyozytären Glucosetransportes
auf die subzelluläre Verteilung von Glucosetransportern 61
III.4.1 Einfluß metabolischer Inhibitoren und alternativer Substrate 61
111.4.1.1 Effekt von Rotenon 61
111.4.1.2 Effekt von Pyruvat 65
2 Inhaltsverzeichnis
III.4.1.3 Einfluß von Rotenon und Pyruvat auf die Verteilung der Glucosetransporter
in GLUT4-haltigen Vesikelpopulationen innerhalb der intrazellulären
LDM-Fraktion 68
III.4.2 Einfluß von purinergen Inhibitoren 73
IH.4.2.1 Effekt von ATP 73
IH.4.2.2 Einfluß von ATP auf die Verteilung der Glucosetransporter in GLUT4-
haltigen Vesikelpopulationen innerhalb der intrazellulären LDM-Fraktion.... 76
111.5 Immunzytologischer Nachweis von GLUT4 und GLUT1 in Herzmuskelzellen 81
111.5.1 Lokalisation von GLUT4 81
111.5.2 Lokalisation von GLUT1 88
111.6 Versuch der Isolierung und Identifizierung eines mit GLUT4 in den LDM-
Vesikelpools kolokalisierten Proteins 93
iv Diskussion 98
IV. 1 Glucosetransport und Verteilung der Glucosetransporter GLUT4 und GLUT 1
in Membranfraktionen der Herzmuskelzelle 99
IV.2 Effektoren des Glucosetransportes und der zellulären Verteilung von GLUT4
undGLUTl 100
IV.2.1 Insulin 100
IV.2.2 Metabolische Inhibitoren 101
IV.2.3 Alternative Substrate 103
IV.2.4 Purinerge Agenzien 104
IV.3 Identifizierung und Charakterisierung von intrazellulären GLUT-haltigen
Membranvesikeln 105
IV.3.1 Zellbiologische Natur der subzellulären Membranfraktionen 105
IV.3.2 Vesikuläre Zusammensetzung der LDM-Fraktion 107
IV.3.3 Insulin-bedingte Rekrutierung von GLUT4 und GLUT1 aus den LDM-
Vesikelpopulationen 109
IV.3.4 Mobilisierung von GLUT4 und GLUT1 in LDM-Vesikelpopulationen durch
zu Insulin alternative Modulatoren 112
IV.4 Lokalisierung intrazellulärer GLUT-haltiger Kompartimente in der konfokalen
Laser-Scan-Mikroskopie 116
IV.4.1 GLUT4 117
IV.4.2 GLUT1 120
IV.5 Versuch der Isolierung und Identifizierung eines für die LDM-Vesikelpools
spezifischen Proteins 121
IV.6 Mechanismen der Glucoseaufnahme 123
v Zusammenfassung 124
vi Literaturverzeichnis 128
vn Anhang 143
Abkürzungsverzeichnis 143
Publikationsliste 145
Danksagungen 146
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