Modulation einer mit b2-Integrinenbeta-2-Integrinen assoziierten Signaltransduktionskaskade durch intrazelluläre RNA-Aptamere:
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| Published: |
München
Utz, Wiss.
2001
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| Series: | Biochemie
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| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
INTRAZELLULAERER
PROTEINE
1
1.1.1
GENOMANALYSEN
1
1.1.2
PHARMAKOLOGISCHE
PROTEINCHARAKTERISIERUNG
2
1.1.3
INTRAZELLULAERE
ANTIKOERPER
3
1.2
APTAMERE
5
1.2.1
SPEZIFISCHE
NUKLEINSAEURELIGANDEN
5
1.2.2
DER
IN
VITRO
SELEKTIONSPROZESS
7
1.2.3
BIOLOGISCHE
AKTIVITAETEN
IN
VITRO
SELEKTIERTER
APTAMERE
8
1.3
INTEGRINE
9
1.3.1
DIE
INTEGRINSUPERFAMILIE
9
1.3.2
DIE
LEUKOZYTEN-SPEZIFISCHEN
SS2-LNTEGRINE
11
1.3.3
INDUKTION
DER
DURCH
SS2-LNTEGRINE
VERMITTELTEN
ADHAESION
12
1.3.4
AKTIVIERUNG
DERSS2-LNTEGRINE
DURCH
INTRAZELLULAERE
SIGNALE
13
14
AUFGABENSTELLUNG
17
2
MATERIAL
18
2.1
GERAETE
UND
MATERIALIEN
18
Z2
CHEMIKALIEN
19
2.3
STANDARDS
UND
KITS
21
2.4
ENZYME
UND
PROTEINE
21
2.5
SAEULENMATERIAL
22
2.6
NUKLEOTIDE
UND
RADIOCHEMIKALIEN
22
2.7
SYNTHETISCHE
OLLGONUKLEODDE
23
2.8
PEPTIDE
23
2.9
PLASMIDE
23
Z10
BAKTERIEN-,
VIRENSTAEMME
UND
ZELLLINIEN
23
3
METHODEN
24
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.1
KULTUR
VON
E.
COLI
24
3.1.1
PLATTENKULTUR
24
3.1.2
FLUESSIGKULTUR
24
3.1.3
GLYCERINKULTUR
24
3.1.4
MEDIEN
UND
STOCKLOESUNGEN
24
3.1.5
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
25
31.5.1
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
BAKTERIEN
25
3.1.5.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
26
3.1.5.3
BESTIMMUNG
DER
TRANSFORMATIONSEFFIZIENZ
26
3.2
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
26
3.2.1
ELELEKTROPHORESE
IN
NICHT-DENATURIERENDEN
AGAROSEGELEN
26
3.2.2
ELUTION
VON
DNA
AUS
YYLOW-MELTING-POINT'-AGAROSEGELEN
27
3.2.3
PAEPARATRVE
UND
ANALYTISCHE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
27
3.2.4
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
28
3.3
ALLGEMEINE
METHODEN
ZUR
PROTEINANALYSE
29
3.3.1
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
GILL
UND
VON
HIPPEL
29
3.3.2
SDS-GELELEKTROPHORESE
30
3.3.3
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
31
3.4
ALLGEMEINE
METHODEN
IM
UMGANG
MIT
NUKLEINSAEUREN
31
3.4.1
PHENOL-CHLOROFONN-EXTRAKTION
31
3.4.2
ETHANOL-PRAEZIPITATION
31
3.4.3
ISOPROPANOLFAELLUNG
32
3.4.4
GELFILTRATION
ZUR
ABTRENNUNG
NIEDERMOLEKULARER
BESTANDTEILE
32
3.4.5
PHOTOMETRISCHE
NUKLEINSAEUREBESTIMMUNG
33
3.4.6
CHEMISCHE
OLIGONUKLEOTIDESYNTHESE
33
3.5
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
33
3.5.1
PLASMIDISOLIERUNG
33
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.5.2
DNA-AMPLIFIKATION
34
3.5.3
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
VON
2'-HYDROXY-RNA
35
3.5.4
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
VON
2
'
-MODIFIZIERTER
RNA
35
3.5.5
REVERSE
TRANSKRIPTION
36
3.6
DNA-SEQUENZIERUNG
36
3.7
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
NUKLEINSAEUREN
37
3.7.1
RESTRIKTIONSVERDAU
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
37
3.7.2
LIGATION
MIT
T4
DNA-LIGASE
38
3.7.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
RNA
MIT
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
(CIAP)
38
3.7.4
RADIOAKTIVE
5-ENDMARKIERUNG
VON
RNA
UND
DNA
(KINASIERUNG)
38
3.7.5
RADIOAKTIVE
3-ENDMARKIERUNG
VON
RNA
39
3.7.
6
PARTIELLE ALKALISCHE
HYDROLYSE
VON
RNA
40
3.8
ANALYTISCHE
FILTERBLNDUNGSASSAYS
40
3.9
STRUKTURELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
RNA-APTAMEREN
41
3.9.1
BESTIMMUNG
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
DES
APTAMERSD28
DURCH
NUKLEASE-VERDAU
41
3.9.2
BESTIMMUNG
DES
MINIMALEN
BINDUNGSMOTIVS
VON
APTAMENAN
DURCH
DELETIONSANALYSE
42
3.10
CHARAKTERISIERUNG
DER
BINDUNG
DER
RNA-APTAMERE
AN
PEPTIDE
UND
PROTEINE
43
3.10.1
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
DER
SELEKTIERTEN
APTAMERE
UND
IHRER
TR
EXPRESSIONSKONSTRUKTE
DURCH
ANALYTISCHE
ATFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
43
3.10.2
GELRETARDATION
ZUR
BESTIMMUNG
DER
BINDUNGSSTELLE
DER
APTAMERE
AN
CD18CYT
44
3.10.3
GELRETARDATION
VON
TR-APTAMEREN
MIT
ZELLULAEREM
CD1
8
45
3.11
KULTUR
VON
ZELLINLEN
46
3.12
HERSTELLUNG
REKOMBLNANTER
VACCINLAVIREN
47
3.12.1
INFEKTION
47
3.12.2
TRANSFEKTION
NACH
DER
CALCIUM-PHOSPHAT-METHODE
47
3.12.3
ISOLIERUNG
REKOMBLNANTER
VIREN-PLAQUES
48
3.12.4
AMPLIFIKATION
VON
VACCINIAVIRUS-STOCKLOESUNGEN
49
3.13
ANALYSE
DER
TR-APTAMEREXPRESSLON
IN
JURKATE6-ZELLEN
49
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.13.1
ISOLIERUNG
VON
ZYTOPLASMATISCHER
RNA
49
3.13.2
DOT-BLOT-ANALYSE
ZYTOPLASMATISCHER
TR-APTAMERE
50
3.14
ADHAESION
VON
LEUKOZYTEN
AN
MH
ICAM-1-RG-PROTEIN
BESCHICHTETE
PETRISCHALEN
51
3.14.1
BESCHICHTUNG
VON
PETRISCHALEN
MIT
ICAM-1-RG
51
3.14.2
ADHAESION
STIMULIERTER
LEUKOZYTEN
52
4
ERGEBNISSE
53
4.1
CD18CYT-SPEZLFISCHEAPTAMERE
53
4.1.1
IN
VITRO
SELEKTION
53
4.1.2
FILTERRETENTION
DER
APTAMER/CD18CYT-KOMPLEXE
54
4.2
STRUKTURELLE
ANALYSE
DER
CD18CYT-SPEZLFLSCHEN
APTAMERE
56
4.2.1
BESTIMMUNG
DER
MINIMALEN
BINDUNGSMOTIVE
VON
D20
UND
D28
56
4.2.2
ENZYMATISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
VON
D28
58
4.3
KONSTRUKTION
EINES
VIRALEN
APTAMER-EXPRESSLONSSYSTEMS
62
4.3.1
ZYTOPLASMATISCHE
TRANSKRIPTION
DURCH
DIE
T7-RNA-POLYMERASE
62
4.3.2
DIE
APTAMER-EXPRESSIONSKASSETTE
TR
65
4.4
INTERAKTION
DER
APTAMERE
MIT
DER
SS2-LNTEGRINUNTERELNHEIT
68
4.4.1
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
DER
SELEKTIERTEN
APTAMERE
UND
IHRER
TR-EXPRESSIONSKONSTIUKTE
68
4.4.2
BESTIMMUNG
DER
APTAMERBINDUNGSSTELLE
AN
CD18CYT
70
4.4.3
BINDUNG
DER
APTAMERE
AN
ZELLULAERES
CD1
8
72
4.5
TRANSKRIPTIONSANALYSE
DER
TR-KONSTRUKTE
75
4.5.1
IN
VITRO
TERMINATION
75
4.5.2
ZEITABHAENGIGKEIT
DER
TR-APTAMEREXPRESSION
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
76
4.5.3
QUANTIFIZIERUNG
DER
IN
JURKAT
ES-ZELLEN
EXPRIMIERTEN
TR-APTAMERE
78
4.6
INHIBITION
DER
LFA-1
VERMITTELTEN
ADHAESION
VON
LEUKOZYTEN
80
4.6.1
ADHAESION
VON
LEUKOZYTEN
AN
MIT
ICAM-1
BESCHICHTETE
PETRISCHALEN
80
4.6.2
DIE
EXPRESSION
DES
APTAMERS
TR-D20
BLOCKIERT
DIE
STIMULIERTE
ZELLADHAESION
AN
ICAM-1
81
5
DISKUSSION
84
INHALTSVERZEICHNIS
V
5.1
SS2-LNTEGRINE
UND
SLGNALTANSDUKTION
84
5.1.1
MODULATION
DER
INTEGRINAKTMTAET
84
5.1.2
INHIBITION
DERZYTOPLASMATISCHEN
DOMAENE
DER
SS2-UNTEREINHEIT
85
5.2
FUNKTIONALE
ANALYSEN
MITTELS
INTRAZELLULAERER
APTAMERE
88
5.2.1
DASVACDNIAVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEMFUERTR-APTAMER
88
5.2.2
DIE
UNTERSUCHUNG
DES
INTRAZELLULAEREN
PROTEOMS
89
5.3
VERGLEICH
ZWISCHEN
INTRAZELLULAEREN
ANTIKOERPERN
UND
APTAMEREN
90
5.4
EINSATZ
ZU
THERAPEUTISCHEN
ZWECKEN
91
6
ZUSAMMENFASSUNG
93
7
LITERATUR
95
8
ANHANG
108
8.1
SEQUENZEN
AUS
DER
SELEKTION
GEGEN
CD18CYT
108
8.2
APTAMEREXPNSSLON
VON
POLYMERASE
ILL-PROMOTOREN
109
8.2.1
USS-PROMOTOR-KONMIIERTE
TRANSKRIPTIONSEINHEITEN
109
8.2.2
LOKALISATIONSSIGNALE
FUER
INTRAZELLULAERE
APTAMERE
DURCH
DAS
YYMINIHELIXMOTIV
"
109
8.2.3
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSKASSETTEN
MH-E
UND
MH-N
111
8.3
HERSTELLUNG
VON
NUKLEINSAEURE-BIBLIOTHEKEN
FUER
IN
VITRO
SELEKTIONEN
113
8.
3.
1
DIE
BIBLIOTHEKEN
MIC
MOD
40N
UND
MIC
PR1
40N
113
8.3.2
ANALYSE
DER
NUKLEINSAEUREBIBLIOTHEKEN:
PCR
115
8.3.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
2-MODIFIZIERTEN
RNA-BIBLIOTHEKEN
116
8.3.3.1
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
116
83.3.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
117
8.3.3.3
STABILITAET
DER
MODIFIZIERTEN
RNA-BIBLIOTHEKEN
118
8.3.4
IN
VITRO
SELEKTIONEN
MIT
DEN
RNA-BIBLIOTHEKEN
MIC
MOD
40N
UND
MIC
PR140N
120
8.4
SYNTHETISCHE
OUGONUKLEOTLDE
121
8.4.1
DIE
RNA-BIBLIOTHEKEN
MIC
MOD
40N
UND
MIC
PR
40N
121
8.4.2
DIE
APTAMEREXPRESSIONSKASSETTE
TR
121
VI
INHALTSVERZEICHNIS
8.4.3
DIE
EXPRESSIONSKASSETTEN
MH-E
UND
MH-N
123
8.5
SYNTHETISCHE
PEPTIDE
9
ABKUERZUNGEN
125 |
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