Untersuchungen zur Strukturaufklärung und Regulation des humanen Thromboxan-A2-Rezeptorgens:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
_
L
INHALTSVERZEICHNIS
1.
ABKUERZUNGEN
.
1
2.
EINLEITUNG
.
4
2.1
ARACHIDONSAEUREMETABOLISMUS
.
4
2.2
PROSTANOID-REZEPTOREN
.
6
2.3
THROMBOXAN
A
2
,
-SYNTHASE
UND
-REZEPTOR
.
.,8
2.3.1
THROMBOXAN
A
2
(TXA
2
)
.
8
2.3.2
THROMBOXAN-SYNTHASE
(TXA
2
-SYNTHASE)
.
9
2.3.2.1
MOLEKULARE
EIGENSCHAFTEN
.
10
2.3.2.2
TXA
2
-SYNTHASEINHIBITOREN
.
10
2.3.3
THROMBOXAN-REZEPTOREN
.
11
2.3.3.1
AGONISTEN
UND
ANTAGONISTEN
.
12
2.3.3.2
MOLEKULARE
EIGENSCHAFTEN
.
13
2.3.3.3
SIGNALTRANSDUKTION
.
14
2.3.3.4
CDNA-KLONIERUNG
UND
PRIMAER-STRUKTUR
.
15
2.3.3.5
STRUKTUR
UND
AKTIVITAET
.
16
2.3.3.6
GENOMISCHE
ORGANISATION
.
18
2.3.3.7
REGULATION
DES
TP-REZEPTORS
.
19
2.3.3.8
PATHOPHYSIOLOGIE
.
20
2.4
TRANSKRIPTION
IN
EUKARYONTEN
.
21
2.4.1
TRANSKRIPTION
AUS
TATA-(BOX)-HALTIGEN
PROMOTOREN
BEI
EUKARYONTEN
.
22
2.4.1.1
TRANSKRIPTIONSKONTROLLE
.
22
2.4.2
TRANSKRIPTION
AUS
TATA-(BOX)-LOSEN
PROMOTOREN
BEI
EUKARYONTEN
.
24
2.4.2.1
TFIID-ABHAENGIGE
INITIATOR-AKTIVITAET
.
25
2.4.2.2
ZUSAETZLICHE
KONTROLLELEMENTE
IN
TATA-LOSEN
PROMOTOREN
.
26
2.5
AUFGABENSTELLUNG
.
27
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
28
3.1
MIKROORGANISMEN
.
28
3.2
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
28
3.3
ENZYME
PUFFER
UND
CHEMIKALIEN
.
31
3.4
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
33
3.4.1
PGL3
LUCIFERASE
REPORTER-VEKTOREN
.
37
3.5
LUCIFERASE-VERSUCH
.
42
INHALTSVERZEICHNIS
_
U.
3.5.1
EINFACHER
LUCIFERASE
VERSUCH
.
43
3.5.2
DUAL-REPORTER-SYSTEM
.
44
3.5.2.1
DUAL-LUCIFERASEYY
REPORTER
ASSAY
SYSTEM
.
45
3.5.2.1.1
ZELLLYSE
.
45
3.5.2.1.2
REPORTERGEN-ASSAY
.
45
3.6 PRAEPARATION
VON
PLASMID
DNA
.
46
3.6.1
PLASMIDPRAEPARATION
NACH
QIAGEN
(MODIFIZIERT)
.
46
3.6.2
PLASMIDPRAEPARATION
MIT
QIAGEN
ANIONENAUSTAUSCHER-SAEUIEN
.
47
3.7
DNA-HYDROLYSE
MITTELS
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
48
3.8
GLAETTEN
UEBERSTEHENDER
EINZELSTRANG-DNA.
48
3.9
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
51
3.10
ISOLIERUNG
EINZELNER
DNA-FRAGMENTE
AUS
DEM
AGAROSEGEL
.
52
3.10.1
JETSORB-DNA-EXTRAKTION
.
52
3.10.2 DNA-EXTRAKTION
MIT
QIAQUICK
GEL
EXTRACTION
KIT
.
53
3.11
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOR-DNA
.
54
3.12
DNA-LIGATION
.
55
3.13
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
55
3.13.1
KLONIERUNG
MIT
DEM
,,PCR-SCRIPTYYSK(+)
CLONING
KIT
"
.
56
3.13.2 KLONIERUNG
MIT
DEM
YYSURE
CLONE
YY
LIGATION
KIT
"
.
56
3.14
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
ZELLEN
.
58
3.14.1
HERSTELLUNG
VON
E.
COLI
MGSO
4
-ZELLEN
.
58
3.14.2 HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
E.
COLI
CACL
2
-ZELLEN
.
58
3.15
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
ZELLEN
.
59
3.15.1
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
CACL
2
-ZELLEN
.
59
3.15.2
TRANSFORMATION
VON
SUPERKOMPETENTEN
E.
CO/I-ZELLEN
.
59
3.16
ZN-VLTRO-VERPACKUNG
VON
LAMBDA-PHAGEN-DNA
.
60
3.17
BESTIMMUNG
DES
TITERS EINER
PHAGENLOESUNG
.
61
3.18
LAMBDA-DNA
PRAEPARATION
MIT
QIAGEN
ANIONENAUSTAUSCHER-SAEULEN
.
61
3.19
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
63
3.20
GERICHTETE
EXONUKLEASE
III
DELETIONEN
AN
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
.
65
3.21
DNA-SEQUENZIERUNG
.
69
3.22
SEQUENZGELE
.
72
3.23
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
RNA
.
79
3.24
RNA-PRAEPARATION
.
79
3.24.1
PRAEPARATION
VON
TOTAL-RNA
.
79
3.24.2
MRNA-PRAEPARATION
.
81
3.25
SYNTHESE
VON
CDNA
MIT
HILFE
DER
REVERSEN
TRANSKRIPTASE
.
84
3.26
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
UEBER
YYQIAQUICK
SPIN
"
-SAEULEN
.
86
3.27
POLYMERASE-KETTENREAKTION
MIT
CDNA
(RT-PCR)
.
86
INHALTSVERZEICHNIS
_
[H
3.28
BESTIMMUNG
DES
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTES
DURCH
PRIMER-EXTENSION-ANALYSE.
87
3.29
ZELLKULTUR
.
89
3.29.1
ZELLLINIEN
.
89
3.29.2
UMSETZEN
VON
ZELLLINIEN
.
90
3.30
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
ZELLLINIEN
.
92
3.30.1
ELEKTROPORATION
.
92
3.30.2
TRANSFEKTION
MIT
HILFE
VON
LIPOPROTEINEN
.
93
3.30.2.1
TRANSFEKTIONSREAGENZ
TRANS
FAST
(PROMEGA)
.
93
4.
ERGEBNISSE
.
95
4.1
ISOLIERUNG
VON
PUTATIVEN
PROMOTORBEREICHEN
DES
HUMANEN
TP-REZEPTORGENS
.
95
4.1.1
PRAEPARATION
VON
TXR-X0.
95
4.1.2
AMPLIFIKATION
DER
PUTATIVEN
PROMOTOR-REGIONEN
MIT
HILFE
DER
PCR
.
96
4.2.
KLONIERUNG
DER
PUTATIVEN
PROMOTOR-REGIONEN
.
100
4.2.1
KLONIERUNG
IN
UEBERGANGSVEKTOREN
.
100
4.2.2
KLONIERUNG
IN
DEN
ZIELVEKTOR
PGL3-ENHANCER
.
103
4.3
SEQUENZIERUNG
UND
KORREKTUR
DER
DNA-SEQUENZEN
DER
PROMOTOR-REGIONEN.
108
4.4
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
DER
PROMOTOR-REGIONEN
DES
HUMANEN
TP-REZEPTORGENS
.
112
4.4.1
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
DER
PROMOTOR-REGION
I
.
112
4.4.1.1
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
DURCH
EXONUKLEASE
ILL-VERDAU
.
112
4.4.1.2
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASE-VERDAU.
117
4.4.2
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
DER
PROMOTOR-REGION
II
.
120
4.5
IDENTIFIZIERUNG
DER
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTE
DES
HUMANEN
TP-REZEPTORGENS
.
123
4.6
RT-PCR-ANALYSE
ZELLULAERER
RNA
.
125
4.6.1
EINFLUSS
VON
AGENZIEN
AUF
DIE
PROMOTORAKTIVITAET
DES
TP-REZEPTORGENS
.
130
4.7
REPORTERGENSTUDIEN
DER
PUTATIVEN
PROMOTOR-REGIONEN
DES
HUMANEN
TP-
REZEPTORGENS
.
134
4.7.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
IN
HUMANE
ZELLLINIEN
.
134
4.7.1.1
VORBEREITUNG
DES
TRANSFEKTIONSREAGENZES
YYTRANS
FAST
"
.
135
4.7.1.2
TESTREIHE
FUER
MEG-01
UND
ECV
304
ZELLEN
.
135
4.7.2
TRANSFEKTION
DER
PROMOTOR-DNA-KONSTRUKTE
DES
HUMANEN
TP-REZEPTORGENS
IN
MEG-01
ZELLEN
.
138
4.7.2.1
EINFLUSS
VON
AGENZIEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
PROMOTOR-DNA-KONSTRUKTE
.
141
4.7.2.1.1
TPA
.
141
4.7.2.1.2
FORSKOLIN
.
146
4.7.2.1.3
IBMX
.
146
4.7.3
TRANSFEKTION
DER
PROMOTOR-DNA-KONSTRUKTE
DES
HUMANEN
TP-REZEPTORGENS
IN
INHALTSVERZEICHNIS
_
BI
ECV
304
ZELLEN
.
150
4.7.3.1
EINFLUSS
VON
AGENZIEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
PROMOTOR-DNA-KONSTRUKTE
.
152
5.
DISKUSSION
.
157
5.1
PRIMER-EXTENSION-ANALYSE
.
158
5.2
REPORTERGEN-ANALYSEN
.
160
5.2.1
REPORTERGEN-ANALYSEN
IN
MEG-01
ZELLEN
.
161
5.2.1.1
REPORTERGEN-ANALYSEN
IN
MEG-01
ZELLEN UNTER
STIMULIERTEN
BEDINGUNGEN
.
162
5.2.2
REPORTERGEN-STUDIEN
IN
ECV
304
ZELLEN
.
163
5.2.2.1
REPORTERGEN-ANALYSEN
IN
ECV
304
ZELLEN
UNTER
STIMULIERTEN
BEDINGUNGEN
.
164
5.2.3
PROMOTOR-REGION
II
UND
PROMOTOR-REGION
III
.
164
5.3
RT-PCR-ANALYSE
DER
PUTATIVEN
PROMOTOR-REGIONEN
.
165
5.3.1
RT-PCR-ANALYSE
UNTER
EINFLUSS
VON
AGENZIEN
.
167
5.4
SEQUENZIERUNG
.
168
5.5
AUSBLICK
.
168
6.
ANHANG
.
169
6.1
TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDUNGSSTELLEN
.
169
6.1.1
TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDUNGSSTELLEN
DER
PROMOTOR-REGION
I
.
169
6.1.2
TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDUNGSSTELLEN
DER
PROMOTOR-REGION
II
.
180
6.2
SEQUENZEN
DER
PROMOTOR-REGIONEN
DES
HUMANEN
TP-REZEPTORGENS
.
182
6.2.1
SEQUENZ
DER
PROMOTOR-REGION
1
.
182
6.2.2
SEQUENZ
DER
PROMOTOR-REGION
II
.
183
6.3
HOMOLOGIEVERGLEICHE
ZUR
DARSTELLUNG
VON
SEQUENZUNTERSCHIEDEN
.
184
6.3.1
PROMOTOR-REGION
1
.
184
6.3.2
PROMOTOR-REGION
II
.
186
6.4
SEQUENZEN
DER
DELETIONSMUTANTEN
DER
PROMOTOR-REGIONEN
I
UND
-II
.
188
6.4.1
SEQUENZEN
DER
DELETIONSMUTANTEN
DER
PROMOTOR-REGION
1
.
188
6.4.2
SEQUENZEN
DER
DELETIONSMUTANTEN
DER
PROMOTOR-REGION
II
.
195
7.
LITERATUR
.
198 |
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| spelling | Şaffak, Tamer Verfasser aut Untersuchungen zur Strukturaufklärung und Regulation des humanen Thromboxan-A2-Rezeptorgens vorgelegt von Tamer Şaffak 2000 IV, 218 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Marburg, Univ., Diss., 2000 Hochschulschrift gtt Genregulation (DE-588)4122166-7 gnd rswk-swf Thromboxan (DE-588)4461576-0 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Thromboxan (DE-588)4461576-0 s Genregulation (DE-588)4122166-7 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009304810&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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