Konstruktion von Plasmiden mit den humanen Sequenzen von Thymosin beta 4 und beta 10 sowie von beta-Actin und GAPDH, Korrelation zwischen mRNA- und Proteingehalt von beta-Thymosinen und Actin in HL60-Zellen:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
IV
1
EINLEITUNG
1
1.1
HISTORISCHES
.
1
1.2
THYMOSIN
-
DER
HAUPTVERTRETER
DER
/3-THYMOSINE
.
1
1.3
DIE
FAMILIE
DER
/3-THYMOSINE
.
3
1.4
DIE
PROMYELOZYTISCHE
ZELLINIE
HL60
.
5
2
PROBLEMSTELLUNG
7
3
MATERIAL
UND
METHODEN
8
3.1
SUBSTANZEN
UND
GERAETE
.
8
3.1.1
CHEMIKALIEN
.
8
3.1.2
RADIOAKTIV
MARKIERTE
SUBSTANZEN
.
8
3.1.3
ENZYME
.
8
3.1.4
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
8
3.1.5
ARBEITSGERAETE
.
9
3.1.5.1
HPLC-SYSTEME
.
9
3.1.5.2
SONSTIGE
GERAETE
.
10
3.2
PUFFER,
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
10
3.3
REVERSE-PHASE
HPLC
.
14
3.3.1
ANALYTISCHE
RP-HPLC
.
14
3.3.1.1
PROBENVORBEREITUNG
.
15
3.3.1.2
BERECHNUNG
DES
GESAMTGEHALTS
.
15
3.3.2
PRAEPARATIVE
RP-HPLC
.
16
3.3.3
AMINOSAEUREANALYSE
.
16
3.3.3.1
PROBENVORBEREITUNG
.
16
3.3.3.2
KALIBRIERUNG
UND
BERECHNUNG
.
16
3.4
PROTEINPRAEPARATION
.
18
3.4.1
/3-THYMOSINE
.
18
3.4.1.1
EXTRAKTION
AUS
DEM
GEWEBE
.
18
3.4.1.2
FESTPHASENEXTRAKTION
.
18
3.4.1.3
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.
19
3.4.1.4
CHROMATOFOKUSSIERUNG
.
19
3.4.1.5
PRAEPARATIVE
RP-HPLC
.
19
3.4.2
ACTIN
.
20
3.4.2.1
EXTRAKTION
AUS
DEM
GEWEBE
.
20
3.4.2.2
ISOLATION
AUS
DEM
ACETONPULVER
.
20
INHALTSVERZEICHNIS
3.5
VERWENDETE
ORGANISMEN
.
20
3.5.1
ZELLINIE
HL60
.
20
3.5.2
BAKTERIENSTAMM
E.COLI
DH
5A
.
20
3.6
PLASMIDE
UND
SYNTHETISCHE
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
20
3.6.1
PLASMIDE
.
20
3.6.2
RZPD-PLASMIDE
.
22
3.6.3
SYNTHETISCHE
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
23
3.7
BIOCHEMISCHE
UND
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
24
3.7.1
DNASEL-INHIBITIONSTEST
.
24
3.7.1.1
PROBENVORBEREITUNG
.
24
3.7.1.2
MESSUNG
.
24
3.7.1.3
AUSWERTUNG
.
24
3.7.2
PROTEINBESTIMMUNG
.
25
3.7.3
KULTIVIERUNG
DER
HL60
ZELLEN
.
26
3.7.4
EINLEITUNG
DER
APOPTOSE
BEI
HL60
ZELLEN
MIT
ARAC
.
26
3.7.5
KULTIVIERUNG
DES
BAKTERIENSTAMMS
E.
COLI
DH
5A
.
26
3.8
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
27
3.8.1
DARSTELLUNG
VON
NICHT
RADIOAKTIV
MARKIERTER
SENSE-RNA
.
27
3.8.2
DARSTELLUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
.
27
3.8.2.1
RNA-SONDEN
.
27
3.8.2.2
DNA-SONDEN
.
29
3.8.3
POLYMERASE
KETTENREAKTION
.
29
3.8.4
LIGATION
.
29
3.8.5
ELEKTROPHORESE
.
30
3.8.5.1
AGAROSE-GELE
.
30
3.8.5.2
POLYACRYLAMID-GELE
.
30
3.8.6
TRANSFORMATION
.
31
3.8.7
PLASMIDPRAEPARATION
.
31
3.8.7.1
MINIPRAEPARATION
.
31
3.8.7.2
MAXIPRAEPARATION
.
31
3.8.8
SEQUENZIERUNG
.
32
3.8.9
RNA-ISOLIERUNG
.
32
3.8.10
NORTHERN
BLOT
.
32
3.8.11
RIBONUCLEASE
PROTECTION
ASSAY
.
33
4
ERGEBNISSE
35
4.1
PRAEPARATION
DER
PROTEINE
.
35
4.1.1
/3-THYMOSINE
.
35
4.1.2
ACTIN
.
36
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
PLASMIDE
.
36
4.2.1
THYMOSIN
/3
4
.
37
4.2.1.1
PRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
AUSGANGSPLASMIDS
.
37
4.2.1.2
VERAENDERUNG
DES
INSERTS
.
38
4.2.1.3
MAXIPRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
PLASMIDS
PAT4
.
38
4.2.2
THYMOSIN
SSM
.
39
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.2.1
PRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
AUSGANGSPLASNIIDS
.
39
4.2.2.2
VERAENDERUNG
DES
INSERTS
.
39
4.2.2.3
MAXIPRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
PLASMIDS
PATIO
.
42
4.2.3
/3-ACTIN
.
42
4.2.3.1
PRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
AUSGANGSPLASMIDS
.
42
4.2.3.2
VERAENDERUNG
DES
INSERTS
.
43
4.2.3.3
MAXIPRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
PLASMIDS
PAB
.
45
4.2.4
GAPDH
.
46
4.2.4.1
PRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
AUSGANGSPLASNIIDS
.
46
4.2.4.2
UMKLONIERUNG
UND
VERAENDERUNG
DES
INSERTS
.
46
4.2.4.3
MAXIPRAEPARATION
UND
SEQUENZ
DES
PLASMIDS
PAG
.
48
4.3
VALIDIERUNG
VON
METHODEN
.
49
4.3.1
DNASEL-INHIBITIONSTEST
.
49
4.3.2
DARSTELLUNG
VON
RADIOAKTIVEN
SONDEN
.
50
4.3.2.1
EFFEKTIVITAET
DES
NUKLID-EINBAUS
.
50
4.3.2.2
SONDENSPEZIFITAET
.
51
4.3.3
NORTHERN
BLOT
.
53
4.3.4
RIBONUCLEASE
PROTECTION
ASSAY
.
53
4.4
AUSWIRKUNGEN
VON
ARAC
AUF
HL60
ZELLEN
.
53
4.4.1
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
KONZENTRATION
.
54
4.4.1.1
ZELLZAHL
.
54
4.4.1.2
PROTEINGEHALT
.
54
4.4.1.3
GESAMT-RNA
UND
MRNA
.
57
4.4.2
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
INKUBATIONSDAUER
.
58
4.4.2.1
ZELLZAHL
.
58
4.4.2.2
PROTEINGEHALT
.
61
4.4.2.3
GESAMT-RNA
UND
MRNA
.
61
5
DISKUSSION
65
5.1
KONSTRUKTION
DER
PLASMIDE
PAT4,
PATIO,
PAB
UND
PAG
.
65
5.2
UEBERPRUEFUNG
DER
ANGEWANDTEN
METHODEN
.
68
5.2.1
DNASEL-INHIBITIONSTEST
.
68
5.2.2
DARSTELLUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
.
69
5.2.3
NORTHERN
BLOT
.
69
5.2.4
RIBONUCLEASE
PROTECTION
ASSAY
.
70
5.3
EINFLUSS
VON
ARAC
AUF
HL60
ZELLEN
.
71
5.3.1
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
ARAC
KONZENTRATION
.
.
71
5.3.2
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
INKUBATIONSDAUER
.
73
6
ZUSAMMENFASSUNG
79
LITERATURVERZEICHNIS
80
III |
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