Die Entstehung von t(4;11)-Translokationen bei Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie: mögliche Erklärungsansätze aus der Chromatinstruktur und der beeinträchtigten Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
ZUSAMMENFASSUNG
10
2.
EINLEITUNG
12
3.
PROBLEMSTELLUNG
31
4.
ERGEBNISSE
4.1
SAR/MAR-ANALYSEN
IN
DEN
GENEN
MLL
UND
AF-4
32
4.1.1
IN
VIVO
SAR-ANALYSEN
AM
MENSCHLICHEN
MLL
GEN
33
4.1.2
HERSTELLUNG
GENOMISCHER
SONDEN
FUER
IN
VIVO
SAR-ANALYSEN
AM
AF-4
GEN
34
4.1.3
IN
VIVO
SAR-ANALYSEN
AM
MENSCHLICHEN
AF-4
GEN
35
4.1.4
IN
VITRO
MAR-ANALYSEN
AN
DEN
MENSCHLICHEN
GENEN
MLL
UND
AF-4
36
4.1.4.1
MATRIX-BINDUNGSEXPERIMENTE
MIT
DEM
KLON
PAC58J
12
37
4.1.4.2
MATRIX-BINDUNGSEXPERIMENTE
MIT
EINEM
MAR-ELEMENT
AUS
DEM
HUMANEN
SS-INTERFERON-GEN
38
4.1.4.3
ERZEUGUNG
VON
MLL
UND^F-4-SPEZIFISCHEN
DNA-FRAGMENTEN
FUER
DIE
MAR-ANALYSE
39
4.1.4.4
IN
VITRO
MAR-ANALYSEN
MIT
MLL
GENFRAGMENTEN
40
4.1.4.5
IN
VITRO
MAR-ANALYSEN
MIT
AF-4
GENFRAGMENTEN
41
4.2
ANALYSEN
ZUM
V(D)J-REARRANGEMENT
IN
ZELLEN
MIT
EINER
TRANSLOKATION
T(4;LL)
4.2.1
AUFBAU
EINER
NEUEN
METHODE
ZUR
ISOLATION
REARRANGIERTER
IGH-ALLELE
43
4.2.1.1
REARRANGIERTE
IGH-ALLELE
AUS
DEN
ZELLINIEN
LLM,
MV
(4;
11),
RS(4;11)
UND SEM
45
4.2.2
ANALYSEN
AN
DEM
ZUR
ETABLIERUNG
DER
ZELLINIEN
LLM
UND
SEM
VERWENDETEN
PRIMAEREM
BIOPSIEMATERIAL
49
4.2.3
UNTERSUCHUNG
DER
IGH-REARRANGEMENTS
DURCH
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
50
4.2.4
ANALYSE
DER
EXPRESSION
VON
PH-KETTEN-PROTEIN
IN
T(4;
11)
ZELLINIEN
DURCH
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
52
(FORTSETZUNG)
SEITE
4.2.5
RT-PCR
EXPERIMENTE
ZUR
ANALYSE
VON
KOMPONENTEN
DER
V(D)J-REKOMBINATIONSMASCHINERIE
53
4.2.6
UNTERSUCHUNGEN
AM
IGH-LOCUS
IN
PRIMAEREM
BIOPSIEMATERIAL
VON
PATIENTEN
MIT
TRANSLOKATION
T(4;
11)
54
5.
DISKUSSION
59
6.
MATERIAL
UND
METHODEN
6.1
ALLGEMEINES
6.1.1
GERAETE,
ENZYME,
CHEMIKALIEN
73
6.1.2
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
73
6.1.3
OLIGONUKLEOTIDE
73
6.1.4
BAKTERIENSTAEMME
73
6.1.5
MENSCHLICHE
ZELLINIEN
74
6.1.6
NAEHRMEDIEN
UND
ZUSATZSTOFFE
74
6.1.7
STANDARDMETHODEN
75
6.1.8
SEQUENZANALYSEN
75
6.2
EXPERIMENTE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
VON
SAR/MAR
BEREICHEN
6.2.1
SCREENING
UND
PRAEPARATION
VON
PAC
DNA
76
6.2.2
IN
VIVO
EXPERIMENTE
ZUR
S
AR-ANALYSE
76
6.2.2.1
SONDEN
ZUR
HYBRIDISIERUNG
MIT
DEM
MENSCHLICHEN
MLL
GEN
76
6.2.2.2
SONDEN
ZUR
HYBRIDISIERUNG
MIT
DEM
MENSCHLICHEN
AF-4
GEN
77
6.2.2.3
VERWENDETE
LOESUNGEN
77
6.2.2.4
PRAEPARATION
VON
ZELLKERNEN
AUS
DER
RAJI-ZELLINIE
79
6.2.2.5
PRAEPARATION
VON
HISTON-DEPLETIERTEN
ZELLKERNEN
79
6.2.2.6
RESTRIKTIONSVERDAU,
DNA-PRAEPARATION
UND
SOUTHERN
BLOT
EXPERIMENTE
79
6.2.3
IN
VITRO
EXPERIMENTE
ZUR
MAR-ANALYSE
80
6.2.3.1
HERSTELLUNG
DER
ZU
UNTERSUCHENDEN
DNA
FRAGMENTE
80
6.2.3.2
LOESUNGEN
81
6.2.3.3
ISOLIERUNG
DER
KEMMATRIX
82
(FORTSETZUNG)
SEITE
6.2.3.4
MATRIX-BINDUNGSEXPERIMENTE
83
63
EXPERIMENTE
ZUR
ANALYSE
VON
V(D)
J-REARRANGEMENTS
IN
ZELLEN
MIT
TRANSLOKATION
T(4;LL)
6.3.1
ZELLINIEN
UND
PATIENTENPROBEN
83
6.3.2
DNA
PRAEPARATION
UND
SOUTHERN
BLOT
EXPERIMENTE
83
6.3.3
INVERSE
PCR
(IPCR)
EXPERIMENTE
84
6.3.4
RT-PCR
EXPERIMENTE
84
6.3.4.1
CDNA
SYNTHESE
84
6.3.5
PROTEINMETHODEN
6.3.5.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
85
6.3.5.2
WESTERN
BLOT
ANALYSEN
85
63.5.3
CYTOPLASMATISCHE
IMMUNFLUORESZENZ
86
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
87
8.
ANHANG
89
9.
LITERATUR
92
10.
NACHDRUCK
DER
EIGENEN
MANUSKRIPTE
111 |
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