Entwicklung eines automatisierten Screeningverfahrens zum Test neuer Transfektionslipide und Untersuchungen zum Mechanismus der Lipofektion:
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Karlsruhe
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
2000
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
UND
AKRONYME
I
INHALTSVERZEICHNIS
HI
1
EINLEITUNG
1
1.1
GENTRANSFER
UND
SOMATISCHE
GENTHERAPIE
1
1.1.1
METHODEN
DES
GENTRANSFERS
1
1.1.2
VIRUSVERMITTELTER
GENTRANSFER
KONTRA
LIPOFEKTION
2
1.2
LIPOFEKTION
3
1.2.1
PRINZIPIEN
DER
LIPOFEKTION
MITTELS
KATIONISCHER
LIPIDE
3
1.2.2
STAND
DER
FORSCHUNG
5
1.2.2.1
TRANSFEKTIONSREAGENZIEN
5
1.2.2.2
LIPOPLEXMORPHOLOGIE
6
1.2.2.3
TRANSFEKTIONSMECHANISMUS
7
1.2.2.4
ZELLSYSTEME
8
1.2.2.5
REPORTERGENE
9
1.2.3
LIPOFEKTION
IN
EINEM
MODELLSYSTEM
10
1.2.3.1
SCREENINGGEDANKE
10
1.3
AUFGABENSTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
11
2
MATERIAL
UND
METHODEN
12
2.1
MATERIALIEN
12
2.1.1
LIPIDE/TRANSFEKTIONSREAGENZIEN
12
2.1.2
PLASMIDE
UND
ZUGEHOERIGE
SUBSTANZEN
12
2.1.2.1
PLASMIDE_
12
2.1.2.2
SUBSTANZEN
FUER
DIE
PLASMIDREINIGUNG
13
2.1.2.3
SUBSTANZEN
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
_
13
2.1.3.
ASSAYS
UND
ZUGEHOERIGE
PUFFER
13
2.
1.3.1
ASSAYS
UND
ZUGEHOERIGE
REAGENZIEN
13
2.1.3.2
PUFFER
13
2.1.4
IN
DER
ZELLKULTUR
EINGESETZTE
SUBSTANZEN
14
2.1.5
SONSTIGE
CHEMIKALIEN
14
INHALTSVERZEICHNIS
2.2
METHODEN
15
2.2.1
KULTIVIERUNG
DER
ZELLEN
15
2.2.2
PLASMIDREINIGUNG
:
16
2.2.3
LIPOSOMENHERSTELLUNG
17
2.2.3.1
MANUELLE
METHODE
17
2.2.3.2
AUTOMATISIERTE
METHODE
17
2.2.3.3
GROESSENBESTIMMUNG
VON
LIPOSOMEN
18
2.2.4
HERSTELLUNG
DER
LIPOPLEXE
UND
TRANSFEKTION
18
2.2.4.1
PROTOKOLL
FUER
DIE
MANUELLE
LIPOPLEXBILDUNG
UND
TRANSFEKTION
18
2.2.4.2
PROTOKOLL
FUER
DIE
AUTOMATISIERTE
LIPOPLEXBILDUNG
UND
TRANSFEKTION
19
2.2.4.3
TRANSFEKTION
BEI
SIMULTANER
VARIATION
VON
LIPID
UND
DNA-MENGE
22
2.2.4.4
ANWENDUNG
DES
AUTOMATISIERTEN
TRANSFEKTIONSVERFAHRENS
AUF
EIN
SCREENINGEXPERIMENT
_
23
2.2.5
POST-TRANSFEKTIONSASSAYS
25
2.2.5.1
BESTIMMUNG
DER
LUCIFERASEAKTIVITAET
UND
DES
PROTEINGEHALTS
DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
IN
MANUELLER
DURCHFUEHRUNG
_
26
2.2.5.2
AUTOMATISIERTES
VERFAHREN
FUER
96-WELL-PLATTEN
27
2.2.6
WEITERE
NACHWEISVERFAHREN
29
2.2.6.1
ZYTOTOXIZITAETSBESTIMMUNGEN
29
2.2.6.2
X-GAL-FAERBUNG
30
2.2.6.3
HEMMUNG
DER
ENDOZYTOSE
30
2.2.6.4
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
31
2.2.6.5
FLUOROMETRISCHE
MESSUNGEN
32
3
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
33
3.1
ENTWICKLUNG
EINES
AUTOMATISIERTEN
VERFAHRENS
ZUR
LIPOFEKTION
KATIONISCHER
LIPIDE
UND
ZUR
BESTIMMUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
IM
96-WELL-PLATTEN
FORMAT
33
3.1.2
LIPOSOMENDARSTELLUNG
35
3.1.2
LIPOPLEXBILDUNG
43
3.1.2.1
ASPEKTE
DER
AUTOMATISIERUNG
43
3.1.2.2
OPTIMIERUNG
DER
VERSUCHSBEDINGUNGEN
47
3.1.3
TRANSFEKTION
62
3.1.3.1
ASPEKTE
DER
AUTOMATISIERUNG
62
3.1.3.2
UNTERSUCHUNG
UND
OPTIMIERUNG
DER
ZELLKULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
64
3.1.4
BESTIMMUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
76
3.1.4.1
AUTOMATISIERUNGSASPEKTE
BEI
DER
PROBENVORBEREITUNG
77
3.1.4.2
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTS
MITTELS
DES
BCA-ASSAYS
81
3.1.4.3
BESTIMMUNG
DER
LUCIFERASEAKTIVITAET
86
3.1.4.4
ERMITTLUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
93
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.
SYSTEMATISCHE
EVALUATION
DER
TRANSFEKTIONSEIGENSCHAFTEN
(SCREENING)
VON
LIPIDEN
UND
LIPIDMISCHUNGEN
97
3.2.1
MEXF462NL
101
3.2.2
HT-29
103
3.2.4
RXF944L
106
3.2.4
16HBE-140
"
108
3.2.5
HUVEC
110
3.2.6
COS-7
112
3.2.7
ZUSAMMENFASSUNG
UND
DISKUSSION
DER
SCREENINGERGEBNISSE
115
3.2.7.1
WELCHE/S
LIPIDL-MISCHUNG
IST
FUER
DIE
TRANSFEKTION
EINER
BESTIMMTEN
ZELL(LINI)E
OPTIMAL?
_
116
3.2.7.2
GIBT
ES
ZWISCHEN
DEN
LIPIDEN
UNTERSCHIEDE
IM
TRANSFEKTIONSVERHALTEN?
116
3.2.7.3
IN
WELCHEM
ZUSAMMENHANG
STEHEN
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
UND
ZYTOTOXIZITAET?
117
3.2.7.4
WELCHER
EINFLUSS
GEHT
VON
DEN
HELFERLIPIDEN
DOPE
UND
CHOLESTEROL
AUS?
117
3.2.7.5
TRETEN
ZELLLINIENSPEZIFISCHE
UNTERSCHIEDE
AUF?
118
3.3
MECHANISTISCHE
ASPEKTE
DER
LIPOFEKTION
121
3.3.1
KINETIK
DER
LIPOPLEXAUFNAHME
121
3.3.2
EINFLUSS
DER
ENDOZYTOSE
AUF
DIE
LIPOFEKTION
VON
COS-7-ZELLEN
127
4
ZUSAMMENFASSUNG/ABSTRACT
133
5
LITERATUR
135 |
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