Biologische Effekte von Gallensäuren auf Kolonkarzinomzelllinien und Kolonepithelzellen:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
AUFBAU
UND
FUNKTION
DES
DARMS
.
1
1.1.1.
DIE
MUCOSA
.
2
1.1.2.
DIE
LAMINA
PROPRIA
.
3
1.1.3.
INTESTINALE
EPITHELZELLEN
.
4
1.1.4.
INTESTINALE
TUMOREN
.
6
1.1.4.1.
KLONALE
SELEKTION
UND
TUMORGENESE
.
6
1.1.4.2.
TUMOREN
DES
DUENNDARMS
.
7
1.1.4.3.
TUMOREN
DES
DICKDARMS
.
8
1.2.
APOPTOSE
.
9
1.2.1.
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
NEKROSE
UND
APOPTOSE
.
9
1.2.1.1.
NEKROSE
.
9
1.2.1.2.
APOPTOSE
.
10
1.2.2.
PHASEN
DER
APOPTOSE
.
12
1.2.3.
METHODEN
DES
APOPTOSENACHWEISES
.
13
1.2.4.
MEDIATOREN
DER
APOPTOSE
.
14
1.2.5.
MITOCHONDRIALE
KOMPONENTEN
DER
APOPTOSE
.
15
1.3.
GALLENSAEUREN
.
20
1.3.1.
STRUKTUR
UND
SYNTHESE
DER
HUMANEN
GALLENSAEUREN
.
20
1.3.1.1.
STRUKTUR
DER
GALLENSAEUREN
.
20
1.3.1.2.
SYNTHESE
DER
GALLENSAEUREN
.
20
1.3.2.
EINE
AUSWAHL
DER
WICHTIGSTEN
GALLENSAEUREN
.
22
1.3.3.
ZIRKULATION
DER
GALLENSAEUREN
.
23
1.3.4.
BIOLOGISCHE
EFFEKTE
DER
GALLENSAEUREN
.
26
2.
ZIELSETZUNG
.
29
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
30
3.1.
MATERIAL
.
30
3.1.1.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
30
3.1.2.
ZYTOKINE
.
32
INHALTSVERZEICHNIS
II
3.1.3.
ANTIKOERPER
UND
KONJUGATE
.
32
3.1.3.1.
PRIMAERANTIKOERPER
.
32
3.1.3.2.
SEKUNDAERANTIKOERPER
UND
KONJUGATE
.
33
3.1.4.
PEPTIDE
.
33
3.1.4.1.
BREITBANDINHIBITOR
.
33
3.1.4.2.
CASPASE-1
-INHIBITOR
.
34
3.1.5.
STANDARDS
UND
KITS
.
34
3.1.5.1.
KITS
.
34
3.1.5.2.
STANDARDS
.
34
3.1.6.
GERAETE
.
35
3.2.
ZELLKULTURMETHODEN
.
35
3.2.1.
ISOLIERUNG
PRIMAERER
HUMANER
KOLONEPITHELZELLEN
.
35
3.2.1.1.
DARMRESEKTATE
.
35
3.2.1.2.
BIOPSIEN
.
36
3.2.2.
KULTIVIERUNG
PRIMAERER
HUMANER
KOLONEPITHELZELLEN
.
36
3.2.3.
ZELLKULTUR
.
37
3.2.3.1.
ZELLLINIEN
.
37
3.2.3.2.
TEILUNG
DER
ZELLEN
.
39
3.2.3.3.
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
.
39
3.2.3.4.
EINFRIEREN
DER
ZELLEN
.
40
3.2.3.5.
AUFTAUEN
DER
ZELLEN
.
40
3.2.3.6.
ANZUCHT
VON
SPHAEROIDEN
.
41
3.3.
INDUKTION
DER
APOPTOSE
.
42
3.3.1.
APOPTOSE
DURCH
CH-11
.
42
3.3.2.
GALLENSAEURE-INDUZIERTE
APOPTOSE
.
43
3.4.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
METHODEN
.
44
3.4.1.
OPTISCHES
SYSTEM
UND
LICHTDETEKTION
.
44
3.4.2.
ZELL-DUBLETTENDISKRIMINIERUNG
.
46
3.4.3.
DNA-FAERBUNG
ZUM
NACHWEIS
DER
APOPTOSE
.
47
3.4.3.1
.
FAERBUNG
MIT
DEM
CYCLE
TEST
"
PLUS
DNA
REAGENT
KIT
.
47
3.4.3.2.
DOPPELFAERBUNG
GEGEN
CYTOKERATIN
18
UND
PROPIDIUMJODID
.
48
3.4.4.
EINSCHRITT-FAERBUNG
VON
OBERFLAECHENANTIGENEN
.
49
3.4.5.
ZWEISCHRITT-FAERBUNG
VON
ANTIGENEN
.
49
3.4.6.
MITOCHONDRIENFAERBUNG
MIT
JC-1
.
50
3.5.
ELISA
ZUM
NACHWEIS
DER
ZELLAKTIVIERUNG
.
51
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.6.
NUKLEINSAEURETECHNIKEN
.
52
3.6.1.
RNA-ISOLIERUNG
.
52
3.6.2.
CDNA-SYNTHESE
.
52
3.6.3.
PCR
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION)
.
53
3.6.3.1
.
OLIGONUKLEOTIDE
(PRIMER)
.
53
3.6.3.2.
PCR-BEDINGUNGEN
.
53
3.6.4.
EXTRAKTION
FRAGMENTIERTER
DNA
(DNA-LEITER)
.
54
3.7.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
DES
APOPTOSENACHWEISES
.
55
3.7.1.
ZYTOSOLPRAEPARATION
.
56
3.7.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
56
3.7.3.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
57
3.7.3.1
.
HERSTELLUNG
DER
GELE
.
57
3.7.3.2.
PROBENVORBEREITUNG
.
58
3.7.3.3.
LAUFBEDINGUNGEN
.
59
3.7.4.
WESTEM-BLOTTING
(SEMI-DRY-TECHNIK)
.
59
3.7.4.1.
ELEKTROPHORETISCHER
PROTEINTRANSFER
.
59
3.7.4.2.
DETEKTION
DER
PROTEINE
.
60
3.8.
KOLORIMETRISCHE
MESSUNG
DER
CASPASEN-AKTIVIERUNG
.
61
4.
ERGEBNISSE
.
62
4.1.
UNTERSUCHUNG
DER
WIRKUNG
VON
GALLENSAEUREN
AUF
KOLOREKTALE
KARZINOMZELLLINIEN
.
62
4.1.1.
DIE
STIMULIERUNG
MIT
DEOXYCHOLSAEURE
VERURSACHT
MORPHOLOGISCHE
ZELLVERAENDERUNGEN,
DIE
DEN
APOPTOTISCHEN
ZELLTOD
IMPLIZIEREN
.
62
4.1.2.
DEOXYCHOLSAEURE
INDUZIERT
APOPTOSE
IN
VIER
HUMANEN
KOLON
KARZINOMZELLLINIEN
.
63
4.1.3.
NACHWEIS
DER
DEOXYCHOLSAEURE-INDUZIERTEN
DNA
FRAGMENTIERUNG
IM
AGAROSE-GEL
.
64
4.1.4.
KINETIK
DER
DEOXYCHOLSAEURE-VERMITTELTEN
APOPTOSE
.
65
4.1.5.
WIRKUNG
VERSCHIEDENER
GALLENSAEUREN
AUF
KOLOREKTALE
KARZINOMZELLLINIEN
.
67
4.1.6
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT
DER
DEOXYCHOLSAEURE-INDUZIERTEN
APOPTOSE
.
69
4.1.7.
DIE
GALLENSAEURE-INDUZIERTE
APOPTOSE ERFORDERT
KEINE
NEU
SYNTHESE
DER
BETEILIGTEN
PROTEINE
.
71
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.2.
IDENTIFIZIERUNG
DER
MOLEKUELE
UND
SIGNALWEGE,
DIE
AN
DER
WEITERLEITUNG
DES
APOPTOTISCHENSIGNALS
BETEILIGT
SIND
.
74
4.2.1.
PROTEIN
KINASE-C
(PKC)
IST
AN
DER
GALLENSAEUREN-VERMITTELTEN
APOPTOSE
NICHT
BETEILIGT
.
74
4.2.2.
DIE
AKTIVIERUNG
MITOGENER
BZW.
ZELLAKTIVIERENDER
SIGNAL
TRANSDUKTIONSWEGE
VERAENDERT
DIE
APOPTOSERATE
NICHT
.
76
4.2.3.
IDENTIFIZIERUNG
VON
MOLEKUELEN,
DIE
AN
DER
WEITERLEITUNG
DES
APOPTOTISCHEN
SIGNALS
BETEILIGT
SIND
.
77
4.2.4.
HEMMUNG
DER
GALLENSAEURE-INDUZIERTEN
APOPTOSE
DURCH
PEPTIDINHIBITOREN
FUER
CASPASEN
.
80
4.2.5.
DIE
GALLENSAEURE-INDUZIERTE
APOPTOSE
KOLOREKTALER
ZELLLINIEN
VERLAEUFT
UNABHAENGIG
VON
CD95
.
83
4.2.6.
DIE
CD95-EXPRESSION
VARIIERT
AUF
DEN
VERWENDETEN
KOLONKARZINOMZELLLINIEN
.
86
4.2.7.
DIE
DEOXYCHOLSAEURE-INDUZIERTE
APOPTOSE
VERLAEUFT
UNTER
MITOCHONDRIALER
BETEILIGUNG
.
89
4.2.8.
DEOXYCHOLSAEURE
REDUZIERT
DAS
MITOCHONDRIALE
MEMBRANPOTENTIAL
.
91
4.2.9.
URSODEOXYCHOLSAEURE
HEMMT
DIE
DEOXYCHOLSAEURE-INDUZIERTE
APOPTOSE
NICHT
.
94
4.3.
UNTERSUCHUNG
DER
GALLENSAEURE-INDUZIERTEN
APOPTOSE
AN
EX-VIVO
KOLONEPITHELZELLEN
.
97
4.3.1.
DEOXYCHOLSAEURE
LOEST
IN
PRIMAEREN
INTESTINALEN
KOLONEPITHEL
ZELLEN
KEINE
APOPTOSE
AUS
.
97
4.3.2.
PRIMAERE
KOLONEPITHELZELLEN
UND
KOLOREKTALE
KARZINOMZELLLINIEN
ZEIGEN
UNTERSCHIEDE
IN
DER
EXPRESSION
VON
BAX
UND
BCL-2
.
100
4.3.3.
BCL-2
REDUZIERT
DIE
INDUKTION
DER
APOPTOSE
IN
KOLOREKTALEN
KARZINOMZELLLINIEN
.
101
4.3.4.
DIE
DEOXYCHOLSAEURE-INDUZIERTE
APOPTOSE
IST
UNABHAENGIG
VOM
DIFFERENZIERUNGSGRAD
DER
ZELLEN
.
103
4.3.5.
MIT
DEOXYCHOLSAEURE
INKUBIERTE
SPHAEROIDE
AUS
HT-29-ZELLEN
UNTERLIEGEN
KEINER
APOPTOSE
.
105
4.3.6.
HT-29-ZELLEN
IN
SPHAEROIDEN
VERAENDERN
DAS
EXPRESSIONS
MUSTER
VON
BAX
UND
BCL-2
NICHT
.
107
INHALTSVERZEICHNIS
V
5.
DISKUSSION
.
109
5.1.
KINETIK
UND
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT
DER
ZYTOTOXIZITAET
PHYSIO
LOGISCHER
HUMANER
GALLENSAEUREN
AUF
HUMANE
KOLONKARZINOM
ZELLLINIEN
.
109
5.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
DER
MOLEKUELE,
DIE
AN
DER
WEITER
LEITUNG
DES
APOPTOTISCHEN
SIGNALS
BETEILIGT
SIND
.
115
5.3.
DIE
SPALTUNG
VON
CASPASEN
DIENT
ALS
BIOCHEMISCHER
INDIKATOR
DER
APOPTOSEAUSLOESUNG
DURCH
GALLENSAEUREN
IN
KOLONKARZINOMZELLLINIEN
.
118
5.4.
CD95
IST
AN
DER
INDUKTION
DER
APOPTOSE
DURCH
TOXISCHE
GALLEN
SAEUREN
IN
KOLONKARZINOMZELLLINIEN
NICHT
BETEILIGT
.
124
5.5.
DEOXYCHOLSAEURE
AKTIVIERT
DIE
MITOCHONDRIALE
PERMEABILITAETS-TRANSITION
.
127
5.6.
URSODEOXYCHOLSAEURE
HAT
UNTERSCHIEDLICHE
WIRKUNGEN
AUF
KOLON
KARZINOMZELLLINIEN,
HEPATISCHE
KARZINOMZELLEN
UND
HEPATOZYTEN
.
130
5.7.
PRIMAERE
INTESTINALE
EPITHELZELLEN
UNTERLIEGEN
KEINER
GALLENSAEURE
VERMITTELTEN
APOPTOSE
.
134
.8.
MIT
DEOXYCHOLSAEURE
INKUBIERTE
SPHAEROIDE
AUS
HT-29-ZELLEN
UNTERLIEGEN
KEINER
APOPTOSE
.
141
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
146
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
147
8.
ANHANG:
VEROEFFENTLICHUNGEN
UND
POSTER
.
167 |
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