Metabolismus und pharmakodynamische Effekte des Zytostatikums Busulfan als Ursache unerwünschter Arzneimittelwirkungen: molekulare und klinische Untersuchungen
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| adam_text | METABOLISMUS UND PHARMAKODYNAMISCHE EFFEKTE DES ZYTOSTATIKUMS BUSULFAN
ALS URSACHE UNERWUENSCHTER ARZNEIMITTELWIRKUNGEN: MOLEKULARE UND
KLINISCHE UNTERSUCHUNGEN DEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAETEN DER
FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET ERLANGEN-NUERNBERG ZUR ERLANGUNG DES
DOKTORGRADES VORGELEGT VON CHRISTOPH RITTER AUS BACKNANG
INHALTSVERZEICHNIS *_ INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 1.1 LEUKAEMIEN 1
1.1.1 AKUTE LYMPHATISCHE LEUKAEMIE 2 1.1.2 AKUTE MYELOISCHE LEUKAEMIE 3
1.1.3 CHRONISCHE LYMPHATISCHE LEUKAEMIE 4 1.1.4 CHRONISCHE MYELOISCHE
LEUKAEMIE 5 1.2 BUSULFAN 6 1.3 VENOESE VERSCHLUSSERKRANKUNG 7 1.4
BIOTRANSFORMATION UND GLUTATHION-S-TRANSFERASEN 8 1.5 AUFGABENSTELLUNG 9
2 ERGEBNISSE. 10 2.1 BESTIMMUNG DER AKTIVITAET VON
GLUTATHION-S-TRANSFERASEN 10 2.1.1 GC-MS-ANALYTIK 10 2.1.1.1
VORBEMERKUNG 10 2.1.1.2 CHROMATOGRAMME 11 2.1.1.3 VALIDIERUNG 12 2.1.2
IN VITRO-INKUBATIONEN 14 2.1.2.1 PROTEINABHAENGIGKEIT 14 2.1.2.2
ZEITABHAENGIGKEIT 15 2.1.2.3 GSH-ABHAENGIGKEIT 16 2.1.2.4 PH-ABHAENGIGKEIT
17 2.1.2.5 ENZYMKINETIK 17 2.1.2.6 INKUBATION REKOMBINANTER
GLUTATHION-S-TRANSFERASEN 18 2.2 UNTERSUCHUNGEN AM ZELLMODELL 19 2.2.1
ETABLIERUNG DES ZELLMODELLS 19 2.2. 2.2. 2.2. 2.2. 2.2. 2.2. AUSWAHL DER
ZELLLINIE 20 .2 TRANSFEKTIONSVEKTOR 21 .3 KLONIERUNG DER CDNA 22 .4
TRANSFEKTION 23 .5 NACHWEIS DER TRANSFIZIERTEN PROTEINE 25 .6 NACHWEIS
DER PROTEINAKTIVITAET 27 2.2.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR ZYTOTOXIZITAET VON
BUSULFAN 28 2.2.2.1 ZELLZAHL UND VIABILITAET 28 2.2.2.2 ZELLZYKLUSANALYSE
31 2.2.2.3 BESTIMMUNG DER CDC2-KINASEAKTIVITAET 34 . INHALTSVERZEICHNIS
2.2.3 UNTERSUCHUNG ENDOTHELSPEZIFISCHER PROTEINE 35 2.2.3.1 TISSUE
FAKTOR 36 2.2.3.2 PLASMINOGEN AKTIVATOR INHIBITOR (PAI)-L 36 2.3
UNTERSUCHUNGEN IM RAHMEN EINER KLINISCHEN STUDIE 38 2.3.1 ZIELSTELLUNG
38 2.3.2 STUDIENDESIGN UND PATIENTENCHARAKTERISTIK 38 2.3.3
LC-MS-ANALYTIK. 39 2.3.3.1 VORBEMERKUNG 39 2.3.3.2 VALIDIERUNG 40 2.3.4
PHARMAKOKINETIK 42 DISKUSSION 45 4 ZUSAMMENFASSUNG 59 5 MATERIAL UND
METHODEN 61 5.1 MATERIAL 61 5.1.1 BAKTERIEN UND ZELLLINIEN 61 5.1.2
PRIMER 61 5.1.3 CDNA 61 5.1.4 ALLGEMEIN VERWENDETE CHEMIKALIEN, ENZYME
UND MEDIEN 62 5.1.5 LOESUNGEN, PUFFER UND MEDIEN 64 5.1.6 GERAETE UND
HILFSMITTEL 67 5.2 METHODEN 68 5.2.1 ANALYTISCHE METHODEN 68 5.2.1.1
BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 68 5.2.1.1.1 PRAEPARATION VON
LEBERZYTOSOL 68 5.2.1.1.2 INKUBATION VON LEBERZYTOSOL MIT BUSULFAN 68
5.2.1.1.3 INKUBATION VON REKOMBINANTEN GSTS 68 5.2.1.1.4 KALIBRIERUNG
UND STANDARDISIERUNG 69 5.2.1.1.5 INSTRUMENTE UND BEDINGUNGEN 69
5.2.1.1.6 VALIDIERUNG DER METHODE 70 5.2.1.2 BESTIMMUNG VON
PLASMASPIEGELN 70 5.2.1.2.1 PROBENAUSSEREILUNG 70 5.2.1.2.2 KALIBRIERUNG
UND STANDARDISIERUNG 71 5.2.1.2.3 INSTRUMENTE UND BEDINGUNGEN 71
5.2.1.2.4 VALIDIERUNG DER METHODE 72 5.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
72 5.2.2.1 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN MIT PLASMIDEN 72 5.2.2.2
ISOLIERUNG VON PLASMIDEN AUS BAKTERIEN 72 5.2.2.3 QUANTIFIZIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN 73 5.2.2.4 PRAEPARATIVER VERDAU VON PLASMID-DNA 73 5.2.2.5
ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA 74 INHALTSVERZEICHNIS^ .OEL
5.2.2.6 ISOLIERUNG VON CDNA-FRAGMENTEN AUS EINEM AGAROSEGEL 74 5.2.2.7
ETHANOLPRAEZIPITATION .-. 74 5.2.2.8 DEPHOSPHORYLIERUNG VON
LINEARISIERTEN VEKTOREN 74 5.2.2.9 PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION 75
5.2.2.10 LIGASEREAKTION 75 5.2.2.11 NULDEOTIDSEQUENZANALYSE 75 5.2.3
ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 77 5.2.3.1 ZELLKULTIVIERUNG 77 5.2.3.2
BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 78 5.2.3.2.1 LEBENDZELLZAHL MIT DER
NEUBAUERZAEHLKAMMER 78 5.2.3.2.2 LEBENDZELLZAHL MIT DER MIT-KEAKTION 78
5.2.3.2.3 ELEKTRISCHE ZELLZAHLBESTIMMUNG 78 5.2.3.3 KULTIVIERUNG VON
ZELLEN UNTER SUBSTANZEINWIRKUNG 79 5.2.3.4 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN
79 5.2.3.5 TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT PLASMIDEN 80 5.2.3.6 ISOLIERUNG
EINZELNER ZEILKLONE 80 5.2.3.7 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN 80 5.2.3.8
FIXIERUNG VON ZELLEN 81 5.2.4 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 81 5.2.4.1
QUANTIFIZIERUNG DES PROTEINGEHALTS 81 5.2.4.2 VORBEREITUNG DER PROBEN
ZUR,ELEKTROPHORETISCHEN TRENNUNG 81 5.2.4.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 82 5.2.4.4 TRANSFER UND
IMMUNDETEKTION 83 5.2.4.5 IMMUNFLUORESZENZ 85 5.2.5 DURCHFLUSSZJ
(OMETRISCHE METHODEN 85 5.2.5.1 ERMITTLUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 86
5.2.5.2 DNA-GEHALTSMESSUNG MIT PROPIDIUMIODID 86 5.2.6 ELISAS 87 5.2.6.1
BESTIMMUNG DER CDC2-AKTIVITAET 87 5.2.6.2 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION
VON PAI-1 87 5.2.7 RNA-ANALYTISCHE METHODEN 88 5.2.7.1 PRAEPARATION VON
GESAMT-RNA AUS ZELLEN 88 5.2.7.2 UNTERSUCHUNG DER RNA-INTEGRITAET MITTELS
GELELEKTROPHORESE 89 5.2.7.3 HERSTELLUNG DER CRNA-SONDE ZUR NORTHERN
BLOT-HYBRIDISIERUNG 89 5.2.7.4 NORTHERN BLOT 90 5.2.8 KLINISCHE STUDIE
90 5.2.8.1 PATIENTENCHARAKTERISTIK 91 5.2.8.2 STUDIENDESIGN 91 5.2.9
STATISTISCHE UND MATHEMATISCHE METHODEN 92 6 LITERATURVERZEICHNIS 93
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