Expression und Synthese verschiedener Konstrukte des Zytoskelettproteins "VASP" durch Mikroinjektion von cDNA-Plasmiden in Gefäßendothelzellen:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
_
3
1.1
U
NTERSUCHUNG
VON
R
EPORTERGENEN
MIT
H
ILFE
VON
P
LASMIDEN
.
3
1.1.
1
TRANSFEKTIONSMETHODEN
AN
KULTIVIERTEN
SDUGETIERZELLEN
.
4
1.2
F
UNKTION
DES
G
EFAEBENDOTHELS
.
6
1.3
D
AS
KONTRAKTILE
Z
YTOSKELETT
DES
G
EFAEBENDOTHELS
.
8
1.4
Z
ELLULAERE
F
UNKTION
DES
VASP
P
ROTEINS
.
11
1.5
D
AS
,
GRUEN
-
FLUORESZIERENDE
P
ROTEIN
"
(
GFP
)
.
13
1.6
F
RAGESTELLUNG
DER
A
RBEIT
.
14
2
MATERIAL
UND
GERAETEVERZEICHNIS
_
15
2.1
E
NDOTHELZELLPRAEPARATION
UND
Z
ELLKULTUR
.
15
2.1.1
MEDIEN.
.
15
2.1.2
PLASTIKARTIKEL
.
15
2.1.3
ENZYME
.
15
2.1.4
DECKGLAESER.
.
15
2.1.5
BRUTSCHRANK
.
15
2.1.6
ZENTRIFUGEN
.
16
2.2
MLKROINJEKTLON
.
16
2.2.1
INJEKTIONSKAPILLARENHERSTELLUNG
.
16
2.2.2
INJEKTIONSEINRICHTUNG
.
16
2.2.3
INJEKTIONSLOESUNGEN
.
16
2.2.4
PIPETTENSPITZEN
.
16
2.3
F
LUORESZENZMIKROSKOPIE
.
17
2.3.1
FIXIERUNGSREAGENZIEN
.
17
2.3.2
DETERGENZIEN
ZUM
PERMEABTHSIEREN
.
17
2.3.3
ABSAETTIGUNG
UNSPEZIFISCHER
ANTIKOERPERBINDUNGEN
.
17
2.3.4
PRIMAERANTIKORPER
.
17
2.3.5
SEKUNDAERANTIKOERPER
.
17
2.3
6
REAGENZIEN
ZUM
EINDECKEN
DER
ZELLKULTUREN
.
17
2.3.7
PUFFER.
.
18
2.4
G
ELATINIERENDER
D
ECKGLAESER
.
18
2.5
M
IKROSKOPE
.
IS
2.6
P
HOTOGRAPHISCHE
D
OKUMENTATION
.
18
3
METHODEN
_
19
3.1
Z
ELLKULTUR
.
19
3.1.1
PRAEPARATION
UND
KULTIVIERUNG
VON
ENDOTHELZELLEN
AUS
DEM
TRUNCUS
PULMONALIS
DES
SCHWEINES
.
19
3.1.2
GELATINIEREN
DER
CELLOCATE-GLAESER
UND
DER
T25-KULTWFLASCHEN
.
20
3.1.3
FIXIERUNG
UND
PERMEABILISIERUNG
DER
KULTIVIERTEN
ENDOTHELZELLEN
FUER
DIE
IMMUNFLUORESZENZ-UNTERSUCHUNGEN
.
20
3.2
D
IE
M
IKROINJEKTION
.
21
3.2.1
VORBEHANDLUNG
DER
ENDOTHELZELLEN
FUER
DIE
MIKROINJEKTION
.
21
3.2.2
DIE
HERSTELLUNG
DER
MIKROINJEKTIONSKAPILLAREN
.
21
3.2.3
BELADEN
DER
MIKROKAPILLAREN
MIT
PLASMID-CDNA
.
22
3.2.4
MIKROMANIPULATION
.22
3.2.5
DRUCKLUFTGESTEUERTE
MIKROINJEKTION
.23
3.3
B
ESTIMMUNG
DER
I
NJEKTIONSVOLUMINA
.
23
3.4
B
ESTIMMUNG
P
LASMID
-
C
DNA-K
ONZENTRATION
.
24
4
UEBERSICHT
DER
DURCHGEFUEHRTEN
VERSUCHE
_
25
5
ERGEBNISSE
.
26
5.1
B
ESTIMMUNG
DER
APPLIZIERTEN
V
OLUMINA
BEI
DER
M
IKROINJEKTION
.
26
5.2
M
IKROINJEKTION
VON
V
INCULINANTIKOERPERN
.
26
5.2.1
ZYTOPLASMATISCHE
INJEKTION.
.
27
5.2.2
INTRANUKLEAERE
INJEKTION
.
28
5.3
E
FFEKTIVITAET
DER
T
RANSFEKTION
VON
HUMANEM
VASP
.
29
5.3
1
KRITISCHE
KONZENTRATION
DER
PLASMID-CDNA
FUER
DEN
NACHWEIS
VON
VASP
BZW.
EGFP-
VASP
.
29
5.3.2
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
.
30
5.3.3
ZEITPUNKT
DES
FRUEHESTMOEGLICHEN
NACHWEISES
EINER
ERFOLGTEN
VASP
BZW.
EGFP-VASP
SYNTHESE
.30
5.3.4
INTRAZELLULAERE
VERTEILUNG
DES
TRANSSSZIERTEN
HUMANEN
VASP
BZW.
DES
EGFP-VASP
FUSIONSPROTEINS
.
31
6
DISKUSSION
_
33
6.1
D
IE
M
IKROINJEKTIONSTECHNIK
.
33
6.2
E
FFEKTIVITAET
DER
T
RANSFEKTION
VON
KULTIVIERTEN
E
NDOTHELZELLEN
MIT
H
ILFE
DER
M
IKROINJEKTION
.
34
6.2.1
ZEITFENSTER.
.36
6.2.2
EINFLUSS
VON
TRANSKRIPTIONSFAKIOREN
AUF
DIE
EFFEKTIVITAET
VON
TRANSFEKTIONEN.
.
37
6.3
I
NTRAZELLULAERE
V
ERTEILUNG
DES
TRANSFIZIERTEN
VASP
BZW
.
EGFP
VASP
.
39
7
ZUSAMMENFASSUNG
_
41
8
LITERATUR
-------------------------------------------------------------------------------------
43
DANKSAGUNG
UND
LEBENSLAUF
2 |
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