Expression, biochemische Charakterisierung und biologische Wirksamkeit der equinen Zytokine Interleukin 2 und Interleukin 4:
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| adam_text | Titel: Expression, biochemische Charakterisierung und biologische Wirksamkeit der equinen Zytokine Interleu
Autor: Dohmann, Karen Brigitte
Jahr: 2000
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGEN und DEFINITIONEN
1 EINLEITUNG...............................................................................................13
2 LITERATURÜBERSICHT.........................................................................IS
2.1 Zytokine.........................................................................................................15
2.2 Zytokinmuster verschiedener T-Lymphozyten..........................................16
2.3 Regulation der T-ZeU-Differenzierung.......................................................17
2.4 Vergleich des Interleukin 2 verschiedener Spezies................................... 19
2.4.1 Biologische Wirkung von Interleukin 2.........................................................22
2.5 Vergleich des Interleukin 4 verschiedener Spezies...................................24
2.5.1 Biologische Wirkung von Interleukin 4.........................................................27
2.6 TH1- und TH2-Antwort bei verschiedenen Tierarten..............................31
2.7 Equines Interleukin 2...................................................................................33
2.8 Equines Interleukin 4...................................................................................34
3 GERÄTE, MATERIAL und METHODEN..............................................35
3.1 Geräte............................................................................................................35
3.2 Material.........................................................................................................36
3.2.1 Verbrauchsmaterialien................................................................................... 36
3.2.2 Chemikalien und Reagenzien.........................................................................37
3.2.3 Antikörper und Konjugate..............................................................................39
3.2.4 DNA-Längen- und Mengenstandards............................................................40
3.2.5 Medien und Serumzusätze.............................................................................40
3.2.6. Lösungen und Puffer......................................................................................41
3.2.6.1 zur Plasmidamplifikation und -präparation..........................................41
3.2.6.2 zur DNA-Analyse.................................................................................43
3.2.6.3 flirmRNA-Präparation.........................................................................44
3.2.6.4 für die Reverse Transkription und Polymerase Ketten Reaktion..........45
3.2.6.5 zum Fixieren von bovinen mononukleäen Zellen (Referenzzellen).....45
3.2.6.6 für Membranimmunfluoreszenz und Zytopiasmafarbung....................45
3.2.6.7 zur Aufreinigung von Proteinen............................................................46
3.2.6.8 für SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)..................47
3.2.6.9 Transferpuffer für das Westem Blotting...............................................48
3.2.6.10 für den Immunoblot..............................................................................49
3.2.7 Materialien zur DNA-Präparation..................................................................50
3.2.7.1 Jet Star Plasmid Midiprep Kit................................................................50
3.2.7.2 Jetsorb DNA Extraktion Kit..................................................................50
3.2.8 DNA-modifizierende Enzyme........................................................................50
3.2.9 Plasmide.........................................................................................................51
3.2.10 Primer.............................................................................................................51
3.2.11 CHO-Zellen....................................................................................................51
3.2.12 Tiere............................................................................................................... 51
3.3 Methoden......................................................................................................52
3.3.1 Spaltung von DNA.........................................................................................52
3.3.2 Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Reinigung von DNA............................52
3.3.3 Analytische DNA-Gelelektrophorese............................................................53
3.3.4 Klonierung von equiner Zytokin-cDNA in den Expressionsvektor
pcDNA3.1(-)/Myc-His...................................................................................54
3.3.4.1 Isolierung der IL2-und IL4-CDNA................................................................54
3.3.4.2 Präparative DNA-Gelelektrophorese............................................................. 56
3.3.4.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen.....................................56
3.3.4.4 Ligation..........................................................................................................57
3.3.4.5 Präparation kompetenter Bakterien................................................................58
3.3.4.6 Transformation...............................................................................................59
3.3.4.7 Untersuchung transformierter Bakterien........................................................60
3.3.4.8 Präparation von Plasmid-DNA.......................................................................61
3.3.5 Zellkultur........................................................................................................62
3.3.5.1 Kultivierung von CHO-Zellen....................................................................... 62
3.3.5.2 Kryokonservierung........................................................................................63
3.3.5.3 Transiente Transfektion..................................................................................63
3.3.5.4 mRNA-Isolierung...........................................................................................64
3.3.5.5 Reverse Transkription (RT) und Polymerase-Ketten Reaktion (PCR)..........65
3.3.5.6 Durchflußzytometrie......................................................................................69
3.3.5.6.1 Zytoplasmafärbung...............................................................................69
3.3.6 Proteinaufreinigung über Histidinreste..........................................................72
3.3.7 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)........73
3.3.8 Westem Blotting............................................................................................75
3.3.9 Immunoblotting..............................................................................................75
3.3.10 Untersuchungen zur biologische Aktivität der equinen Zytokine..................76
3.3.10.1 Isolierung equiner mononukleärer Zellen.............................................76
3.3.10.2 Lymphozytenstimulation......................................................................77
3.3.10.3 Durchflußzytometrische Auswertung der Proliferationsansätze...........78
3.3.10.4 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF).......................................83
4 ERGEBNISSE..............................................................................................86
4.1 Klonierung der equinen IL2- und II 4-cDNA in den
Expressionsvektor........................................................................................86
4.2 Herstellung von rekombinantem equinem IL2 und IL4..........................87
4.2.1 Untersuchung von transfizierten CHO-Zellen auf IL2- und
IL4-mRNA-Expression..................................................................................87
4.2.2 Durchflußzytometrische Analyse transfizierter CHO-Zellen........................89
4.3 Biochemischer Nachweis des equinen IL2 und IL4..................................91
4.3.1 Aufreinigung des rekombinanten equinen IL2 und IL4.................................91
4.3.2 Nachweis im Westem Blot.............................................................................93
4.4 Untersuchung der biologischen Wirksamkeit von equinem
IL2 undIL4...................................................................................................95
4.4.1 Einfluß verschiedener IL2-K.onzentrationen auf die absolute Zahl
mononukleärer und Ig-positiver Zellen..........................................................95
4.4.2 Einfluß verschiedener IL4-Konzentrationen auf die absolute Zahl
mononukleärer, CD4-, CD8- und Ig-positiver Zellen....................................98
4.5 Zusammenfassung der Ergebnisse______________________________101
5 DISKUSSION..............................................................................................102
5.1 Auswahl des Expressionssysteins---------.....„.............................................103
5.2 Biochemische Charakterisierung des rekombinanten equinen 11.2
und 1L4_____________________________________________________104
5.3 Bestimmung des Proteingehaltes der rekombinanten equinen
Zytokine........................................................................................................105
5.4 Biologische Wirksamkeit des rekombinanten equinen IL2 und IL4.__ 106
6 ZUSAMMENFASSUNG............................................................................109
7 SUMMARY................................................................................................. 111
8 LITERATURVERZEICHNIS...................................................................113
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