Einfluß von Antiöstrogenen auf die Expression von östradiolregulierten Genen in der endometrialen Adenokarzinomzellinie RUCA-I:
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1999
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| adam_text | Titel: Einfluß von Antiöstrogenen auf die Expression von östradiolregulierten Genen in der endometrialen
Autor: Zierau, Oliver
Jahr: 1999
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG..................................................................... 1
2. LITERATURÜBERSICHT................................................. 2
2.1. Das Endometrium.............................................................. 2
2.2. Der ovarielle Zyklus der Ratte............................................ 3
2.3. Adenokarzinome des Endometriums................................. 3
2.4. Wirkungsweise von Hormonen.......................................... 5
2.5. Anwendung von Antiöstrogenen........................................ 9
2.6. Die endometriale Adenokarzinomzellinie RUCA-1............. 10
2.7. Clusterin............................................................................. 11
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN........................................ 13
3.1. MATERIAL UND METHODEN.......................................... 13
3.1.1. Material.............................................................................. 13
3.1.1.1. Liste der verwendeten Geräte............................................ 13
3.1.1.2. Verwendete Chemikalien, Biochemikalien und
Verbrauchsmaterial............................................................ 14
3.1.1.3. Zelllinien............................................................................. 14
3.1.1.4. Zellkultur............................................................................. 15
3.1.1.5. Hormone............................................................................. 16
3.1.2. Aligemeine Arbeitsmethoden............................................. 17
3.1.2.1. Kultivierung von permanenten Zellinien............................. 17
3.1.2.2. Primäre Zellkultur............................................................... 18
3.1.2.3. Kultivierung der RUCA-I Zellen auf einer
extrazellulären Matrix......................................................... 18
3.1.2.4. Behandlung der RUCA-I Zellen
mit Steroidhormonen.......................................................... 18
3.1.3. Behandlung der DA/Han-Ratten mit Östrogen
und Antiöstrogenen........................................................... 19
3.1.4. Isolierung von Gesamt-RNA und Detektion
einzelner mRNA Spezies.................................................... 19
3.1.4.1. Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellinien......................... 20
3.1.4.2. Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben....................... 20
3.1.4.3. Gelelektrophorese von RNA.............................................. 21
3.1.4.4. Northern Bfot...................................................................... 21
3.1.4.5. Radioaktive Markierung einer DNA-Sonde........................ 22
3.1.4.6. Hybridisierung mit einer radioaktiv-markierten Sonde....... 23
3.1.5. RT-PCR:........................................................................... 23
3.1.5.1. Reverse Transkription von mRNA..................................... 23
3.1.5.2. Polymerase Kettenreaktion (PCR)..................................... 24
3.1.6. Biochemische Arbeitsmethoden........................................ 25
3.1.6.1. Proteingewinnung aus Gewebeproben............................. 25
3.1.6.2. Deglykosylierungsprotokoll................................................ 26
3.1.6.3. SDS-Polyacrylarnidgeielektrophorese(SDS-PAGE)......... 26
3.1.6.4. Western Blot...................................................................... 28
3.2. ERGEBNISSE................................................................... 29
3.2.1. Charakterisierung des verwendeten Stammes
der Zeilinie RUCA-I............................................................ 29
3.2.2. Expression von Östrogenrezeptorsubtypen.
ER-a und ER-ß in der Zeilinie RUCA-1............................... 29
3.2.3. Expression von Östrogenrezeptorsubtypen
ER-a und ER-ß in Stromazellen des Rattenuterus............. 29
3.2.4. Einfluß der Behandlungen mit Östrogen und
Antiöstrogenen auf das Gewicht der Organe..................... 31
3.2.4.1. Das Uterusgewicht............................................................. 31
3.2.4.2. Das Tumorgewicht............................................................. 32
3.2.4.3. Das Lymphknotengewicht.................................................. 32
3.2.4.4. Das Lungengewicht........................................................... 32
3.2.5. Northern Blot Analysen...................................................... 35
3.2.5.1. Untersuchung der Tumorproben auf
Expression von Komplement C3-mRNA............................ 35
3.2.5.2. Untersuchung der stimulierten RUCA I Zellen
auf Expression von Komplement C3-mRNA...................... 36
3.2.5.3. Expression von Clusterin mRNA in Tumoren
und Lymphknoten.............................................................. 36
3.2.5.4. Untersuchung der behandelten RUCA I Zellen
auf die Expression von Clusterin mRNA............................ 37
3.2.6. Expression des Clusterin Proteins..................................... 39
3.2.6.1. Untersuchung Clusterin Proteinsynthese in
Tumoren und Lymphknoten.............................................. 39
3.2.6.2. Bildung von Clusterin im Uterus in
Abhängigkeit der Hormonbehandlung................................ 41
3.2.6.3. Untersuchung von Lungenproben mittels
polyktonaler Antikörper gegen Clusterin............................ 42
3.2.6.4. Untersuchung Clusterin Proteinsynthese in
RUCA-I Zellen.................................................................... 42
3.2.7. Nachweis von Isoformen des Clusterins
monoklonaler Antikörper.................................................... 44
3.2.8. Ermittlung des Protein und Zuckeranteils
des Clusterin Glykoproteins............................................... 47
4. DISKUSSION..................................................................... 48
4.1. Einführung.......................................................................... 48
4.2. Expression von Östrogenrezeptorsubtypen
ER-a und ER-ß in derZellinie RUCA-1............................... 50
4.3. Einfluß der Behandlungen mit Östrogenen
und Antiöstrogenen auf die Organgewichte....................... 51
4.4. Transkriptionelle Regulation der Expression
von Komplement C3.......................................................... 53
4.5. Transkriptionelle Regulation der Expression
von Clusterin..................................................................... 53
4.6. Regulation der Proteinsynthese von
Clusterin im Tumor und Lymphknoten............................... 54
4.7. Expression und Translationale Regulation
der Expression von Clusterin im Uterus............................ 55
4.8. Expression von Clusterin in der Lunge............................... 57
4.9. Untersuchung Clusterin Proteinsynthese in
RUCA-I Zellen.................................................................... 57
4.10. Posttranslationelle Modifikation von Clusterin
im Tumor und Lymphknoten.............................................. 57
4.11. Ermittlung der Größe des Proteingerüsts und
des Zuckeranteils des Clusterin Glykoproteins.................. 58
5. SCHLUSSFOLGERUNG................................................... 59
6. AUSBLICK......................................................................... 61
7. ZUAMMENFASSUNG....................................................... 63
8. SUMMARY......................................................................... 64
9 LITERATURVERZEICHNIS............................................... 65
10. ANHANG............................................................................ 78
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